Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM wordt ondersteund door NIH grant P30GM127607 en American Heart Association grant 16SDG29950012. RB wordt ondersteund door P01HL78825 en UM1HL113530.

Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Universiteit van Louisville en goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik.
1. Voorbereiding voor slicing (Een dag voor het snijden)
<ol><li>Bereiding van het trillende microtoom
	<ol>
<li>Plaats het keramische blad in de houder door deze stappen te volgen: plaats na het zorgvuldig uitpakken van het blad de scherpe rand eerst in de sleuf van het bladgereedsch...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Hier beschrijven we de gedetailleerde video protocol voor onze onlangs gepubliceerde methode voor vereenvoudigde medium doorvoer (processen tot 48 plakjes / apparaat) methode die cultuur van varkenshart plakjes mogelijk maakt voor een periode die voldoende lang is om acute cardiotoxiciteit te testen13. De voorgestelde omstandigheden bootsen de omgeving van het hart na, inclusief de frequentie van elektrische stimulatie, beschikbaarheid van voedingsstoffen en intermitterende oxygenatie. We schrijve...

Drug geïnduceerde cardiotoxiciteit is een belangrijke oorzaak van de terugtrekking van de markt1. In het laatste decennium van de20e eeuw werden acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit de markt genomen omdat ze resulteerden in een plotselinge dood als gevolg van ventriculaire hartritmestoornissen2. Bovendien kunnen verschillende anti-kankertherapieën (hoewel in veel gevallen effectief) leiden tot verschillende cardiotoxische effecten, waaronder cardiomyopathie en hartritmestoornissen. Zo kunnen zowel traditionele (bijvoorbeeld anthracyclines en bestraling) als gerichte (bijvoorbeeld trastuzumab) borstkankertherapieën leiden tot cardiovasculaire complicaties bij een subgroep van patiënten3. Een nauwe samenwerking tussen cardiologen en oncologen (via het opkomende veld van "cardio-oncologie") heeft geholpen om deze complicaties beheersbaar te maken ervoor te zorgen dat patiënten effectief kunnen worden behandeld2. Minder duidelijk zijn de cardiovasculaire effecten van nieuwere stoffen, waaronder Her2- en PI3K-remmers, vooral wanneer therapieën in combinatie worden gebruikt. Daarom is er een groeiende behoefte aan betrouwbare preklinische screening strategieën voor cardiovasculaire toxiciteit in verband met opkomende anti-kanker therapieën voorafgaand aan menselijke klinische proeven. Het gebrek aan beschikbaarheid van kweeksystemen voor menselijk hartweefsel dat functioneel en structureel levensvatbaar is voor meer dan 24 uur is een beperkende factor voor betrouwbare cardiotoxiciteitstests. Daarom is er een dringende noodzaak om een betrouwbaar systeem te ontwikkelen voor het kweken van menselijk hartweefsel onder fysiologische omstandigheden voor het testen van toxiciteit van geneesmiddelen.
De recente stap naar het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten (hiPSC-CMs) in cardiotoxiciteitstests heeft een gedeeltelijke oplossing geboden om dit probleem aan te pakken; echter, de onrijpe aard van de hiPSC-CMs en het verlies van weefsel integriteit in vergelijking met meercellige aard van het hartweefsel zijn belangrijke beperkingen van deze technologie4. Een recente studie heeft deze beperking gedeeltelijk overwonnen door de fabricage van hartweefsels van hiPSC-CMs op hydrogels en hen te onderwerpen aan een geleidelijke toename van elektrische stimulatie in de loop van de tijd5. Echter, hun elektromechanische eigenschappen niet bereiken van de volwassenheid gezien in de volwassen menselijke myocardium. Bovendien is het hartweefsel structureel ingewikkelder, dat bestaat uit verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en verschillende soorten stromale fibroblasten die zijn gekoppeld aan een zeer specifiek mengsel van extracellulaire matrixeiwitten6. Deze heterogeniteit van de niet-cardiomyocyte celpopulatie7,8,9 in het volwassen zoogdierhart is een belangrijk obstakel bij het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen. Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden om de kweek van intact hartweefsel mogelijk te maken voor optimale studies met fysiologische en pathologische aandoeningen van het hart5.
Het kweken van menselijke hartplakken is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet 3D meercellig systeem dat vergelijkbaar is met het menselijk hartweefsel dat betrouwbaar de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardkanon kan weerspiegelen. Het gebruik ervan is echter ernstig beperkt door de korte periode van levensvatbaarheid in de cultuur, die niet verder reikt dan 24 uur met behulp van de meest robuuste protocollen die tot 201810,11,12worden gemeld . Deze beperking was te wijten aan meerdere factoren, waaronder het gebruik van lucht-vloeistof interface om de cultuur van de plakjes, en het gebruik van een eenvoudige cultuur medium dat niet ondersteunt de hoge energetische eisen van het hartweefsel. We hebben onlangs een ondergedompeld kweeksysteem ontwikkeld dat in staat is om continue elektrische stimulatie te bieden en de componenten van de cultuurmedia te optimaliseren om hartweefselplakjes tot 6 dagen13levensvatbaar te houden. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests om de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten te dichten. In het huidige artikel, we zijn detaillering het protocol voor het snijden en kweken van het hart plakjes met behulp van een varkenshart als voorbeeld. Hetzelfde proces wordt toegepast op menselijke, hond, schapen of kattenharten. Met dit protocol hopen we de technologie te verspreiden naar andere laboratoria in de wetenschappelijke gemeenschap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Veel nieuwe geneesmiddelen mislukken in klinische studies als gevolg van cardiotoxische bijwerkingen als de momenteel beschikbare in vitro tests en in vivo diermodellen slecht voorspellen menselijke hartverplichtingen, die een multi-miljard dollar last voor de farmaceutische industrie. Vandaar, is er een wereldwijde onvervulde medische behoefte aan betere benaderingen om drugcardiotoxiciteit te identificeren alvorens dure en tijdrovende 'eerst in de mens' proeven aan te gaan. Momenteel worden alleen onrijpe hartcellen (door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten uit stamcellen [hiPSC-CMs]) gebruikt om therapeutische efficiëntie en medicijntoxiciteit te testen, omdat ze de enige menselijke hartcellen zijn die langdurig kunnen worden gekweekt nodig is om de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te testen. Een enkelceltype kan echter het fenotype van het complexe 3D-hartweefsel dat wordt gevormd uit meerdere celtypen niet repliceren. Belangrijk is dat het effect van geneesmiddelen moet worden getest op volwassen cardiomyocyten, die verschillende kenmerken en toxiciteitreacties hebben in vergelijking met onrijpe hiPSC-CMs. Het kweken van menselijke hartschijfjes is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet meercellig systeem dat het menselijk hartweefsel nabootst en de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardium weerspiegelt. Onlangs, door optimalisatie van de cultuur media componenten en de cultuur voorwaarden aan continue elektrische stimulatie op 1,2 Hz en intermitterende oxygenatie van de cultuur medium op te nemen, ontwikkelden we een nieuwe cultuur systeem setup die levensvatbaarheid behoudt en functionaliteit van mens en varken hart plakjes voor 6 dagen in de cultuur. In het huidige protocol geven we als voorbeeld de methode voor het snijden en kweken van varkenshart. Hetzelfde protocol wordt gebruikt om plakjes uit menselijke, honden-, schapen- of kattenharten te kweken. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests die de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten dichten.

Met behulp van een commercieel beschikbare celcultuur elektrische stimulator die plaats biedt aan acht 6 goed platen tegelijk, we geëmuleerd de volwassen hart-milieu door het induceren van elektrische stimulatie op de fysiologische frequentie (1,2 Hz), en gescreend op de fundamentele medium componenten om de duur van functionele varkenshart plakjes in cultuur te verlengen13. Aangezien varkens en menselijke harten zijn vergelijkbaar in grootte en anatomie<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Dit protocol beschrijft hoe hartweefsel te snijden en te kweken onder fysiologische omstandigheden gedurende 6 dagen. Dit cultuursysteem kan worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe harthartfalen therapieën evenals betrouwbare testen van acute cardiotoxiciteit in een 3D-hartmodel.

Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Dit protocol is voor het snijden en kweken van hartweefsel secties gedurende zes dagen onder fysiologische omstandigheden die kunnen worden gebruikt voor acute cardiale toxiciteit testen en het testen van de werkzaamheid van hartfalen therapieën. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend mens in situ-model te worden voor acute cardiale toxiciteitstests die de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten dichten. Het aantonen van de procedures zal Qinghui Qu, een lab manager van ons laboratorium.Om varkenshartweefselplakjes te verkrijgen, voegt u eerst ijs toe aan het tissuebadkoelingsvest van een vibratome en voegt u Tyrode-oplossing toe aan het bad. Gebruik een een liter plastic pot om de gesmolten ijs afvloeiing te verzamelen van het weefsel bad koeljas en breng het varkenshart naar een lade met een liter verse koude cardioplegic oplossing in een bioveiligheid kabinet. Gebruik intrekbare steriele scalpels om het hart te ontleden om de linker ventrikel te isoleren en gebruik rechthoekige scheermesjes om de linker ventrikel in één tot twee kubus centimeter blokken te snijden.Zet een weefselblok opzij om te snijden en plaats de resterende stukken van het weefselblok in een 50 milliliter buis van koude Tyrode-oplossing op ijs. Masseer het gereserveerde weefselblok voorzichtig en voeg één tot twee druppels weefsellijm toe aan de metalen monsterhouder van het vibratome. Plak een stuk van 4% agar blok met een oppervlakte van ongeveer een vierkante centimeter aan de lijm en voeg een tot twee druppels weefsel lijm aan de agar.Bevestig het hartblok aan de agar cardiale epicardium kant naar beneden met het weefsel zo plat mogelijk tegen de houder en plaats de weefselhouder met het hartblok in het snijden bad van het vibratome. Het is van cruciaal belang om het hartblok aan de agar te plakken met de cardiale epicardium kant naar beneden gericht op de weefsellijm en om ervoor te zorgen dat het weefsel zo plat mogelijk is. Bevestig vervolgens de zuurstofbuis aan het snijbad en de metalen lade gevuld met Tyrode-oplossing en plaats 40 micrometercel strainers op de metalen lade om de hartweefselsecties te verzamelen terwijl ze worden gesneden.Gebruik de vibratome-besturingssysteemsoftware om de hoogte van het blad en het monster aan te passen, zodat het mes dicht bij de bovenkant van het weefsel ligt, maar onder de papillaire spieren en vloeistof het weefsel en het mes bedekt. Selecteer vooraf om aan te passen waar te beginnen snijden van het weefsel. Druk op slice om de snelheid te verhogen en gebruik de knop om het blad te verplaatsen naar de rand van het weefsel.Druk nogmaals op segment om te stoppen en verder te gaan om het proces te activeren. Pas vervolgens de snijparameters aan zoals aangegeven en druk op de plak om te beginnen met het snijden van het weefsel. Wanneer het mes het einde van het weefsel bereikt, maar voordat het raakt het einde van het monster houder, druk nogmaals op slice om te stoppen en druk op terug te keren naar de startpositie.Wanneer de plakjes de volledige lengte bereiken en van goede kwaliteit lijken te zijn, gebruik dan een plastic Pasteur pipet gevuld met koude Tyrode-oplossing om het weefsel voorzichtig uit het bad te verzamelen met behulp van tangen en een veerschaar om het plakje zo nodig uit het hart te halen. Plaats elk verzameld plakje in een enkele celzeef in het zuurstofrijk Tyrode-bad en gebruik de oplossing in de pipet om het weefsel op het celzeefoppervlak te drukken. Plaats dan een metalen ring op de bovenkant van het weefsel om het ingekapsjt.Na ten minste een uur in zuurstofrijk Tyrode oplossing, trim de buitenkant van elk segment om eventuele ongelijke randen te verwijderen en lijm het einde van elk segment op een zes millimeter breed stuk van gesteriliseerde polyurethaan printer distributieriem met ingebedde metalen draden. Plaats de ondersteunde hartplakjes in zes-put platen met zes milliliter cultuurmedium per goed en gebruik steriele tangen om ervoor te zorgen dat het weefsel in het midden van de put. Zorg ervoor dat de plaat deksel niet zal raken het weefsel en plaats de plaat op de cultuurplaat, zodat de gebogen kant van de plaat deksel overeenkomt met de schuine kant van de plaat en dat de vierkante hoeken line-up.Plaats de plakjes in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator. Vervang de cultuursupernatants drie keer per dag door zes milliliter vers zuurstofrijk kweekmedium. Sluit de cover aan op de elektrische stimulator van de celcultuur en pas de stimulator aan om continu 10 volt elektriciteit en een 1,2 hertz-frequentie op de hartsegmenten te leveren.Na het aansluiten van de stimulatie, zal het hart plakjes beginnen te kloppen. Elke dag tijdens de middag media verandering, vervang de stimulatie plaat deksel van de cultuur schotel om het vrijkomen van giftige grafiet deeltjes in het cultuurmedium te voorkomen. Plaats de witte schuimplug waar de gebruikte dekking verbinding maakt met de kabel voor de elektrische stimulator van de celkweek om waterschade aan het elektrische circuit te voorkomen en plaats de plaatbedekking in een bad van autoclaved water aangevuld met 2X antibioticum/antimycotic.De volgende dag ontsmet u de plaatbedekking in een 70%ethanol bad gedurende vijf tot 15 minuten voordat u de cover in een vers autoclaved waterbad wordt aangevuld met 2x antibioticum/antimycotic gedurende drie minuten. Gebruik na het spoelen van de plaatdeksel een door ethanol gespoten schoon lintvrij doekje om eventueel restwater uit de kunststof onderdelen te verwijderen en de witte schuimplug te verwijderen. De hoes is dan klaar om terug te worden geplaatst in de cultuurplaat.Met behulp van deze nieuwe biomimetische cultuur setup zoals aangetoond, varkenshart plakjes levensvatbaarheid werd gehandhaafd voor zes dagen, zoals beoordeeld door MTT test. In de eerste zes dagen, vergelijkbaar met de reacties waargenomen voor verse hartplakjes, zijn er geen spontane calciumtransiënten in het varkenshart slice cardiomyocyten. De cardiomyocyten reageerden wel op externe elektrische en bèta-adrenerge stimulatie.Bovendien werden de contractiele kracht en de reacties op isoproterenol gehandhaafd in de hartsnijcultuur gedurende maximaal zes dagen vergelijkbaar met die waargenomen in verse hartschijfjes. Verschillende structurele en functionele beoordelingen kunnen worden uitgevoerd op de hartsegmenten, waaronder MTT-levensvatbaarheidstesten, immunosmeting, elektronenmicroscopie, calcium voorbijgaande metingen, contractielfunctiebeoordelingen, metabole beoordelingen en analyse. We gebruiken dit cultuursysteem momenteel om de acute cardiale toxiciteit en werkzaamheid van geneesmiddelen en gentherapieën van belang in varkens- en menselijke hartsplakjes te testen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik 31 P NMR-spectroscopie

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Vermindering van Linksventriculaire Muur Stress en verbetering in functie in gebreke Harten behulp Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Een gedetailleerd Protocol voor fysiologische Parameters verwerving en analyse in neurochirurgische kritische patiënten

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Cochleaire implantatie in de cavia

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Een minimaal invasieve Model voor het analyseren van Endochondral fractuur genezing in muizen onder gestandaardiseerde condities van de biomechanische

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Functionele en fysiologische methoden voor de evaluatie van mediane zenuwregeneratie in de rat

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...