Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM est soutenu par la subvention des NIH P30GM127607 et la subvention de l’American Heart Association 16SDG29950012. RB est soutenu par P01HL78825 et UM1HL113530.

Toutes les procédures animales étaient conformes aux lignes directrices institutionnelles de l’Université de Louisville et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation pour le tranchage (Un jour avant le tranchage)
<ol><li>Préparation du microtome vibrant
	<ol>
<li>Placez la lame en céramique dans son support en suivant ces étapes : après avoir soigneusement déballé la lame, placez le bord tranchant en premier ...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Ici, nous décrivons le protocole vidéo détaillé pour notre méthode récemment publiée pour le débit moyen simplifié (processus jusqu’à 48 tranches / dispositif) méthode qui permet la culture des tranches de cœur de porc pour une période suffisamment longue pour tester la cardiotoxicité aigue13. Les conditions proposées imitent l’environnement du cœur, y compris la fréquence de stimulation électrique, la disponibilité des nutriments et l’oxygénation intermittente. Nous attr...

La cardiotoxicité induite par la drogue est une cause majeure de retrait du marché1. Dans la dernière décennie du 20e siècle, huit médicaments non-cardiovasculaires ont été retirés du marché car ils ont entraîné la mort subite due à des arythmies ventriculaires2. En outre, plusieurs thérapies anticancéreuses (bien que dans de nombreux cas efficaces) peuvent conduire à plusieurs effets cardiotoxiques, y compris la cardiomyopathie et les arythmies. Par exemple, les thérapies traditionnelles (p. ex., anthracyclines et rayonnement) et les traitements ciblés (p. ex., trastuzumab) du cancer du sein peuvent entraîner des complications cardiovasculaires chez un sous-ensemble de patients3. Une étroite collaboration entre les cardiologues et les oncologues (via le domaine émergent de la « cardio-oncologie ») a contribué à rendre ces complications gérables en veillant à ce que les patients puissent être traités efficacement2. Les effets cardiovasculaires des nouveaux agents sont moins clairs, y compris les inhibiteurs Her2 et PI3K, surtout lorsque les thérapies sont utilisées en combinaison. Par conséquent, il existe un besoin croissant de stratégies de dépistage précliniques fiables pour les toxicités cardiovasculaires associées aux thérapies anticancéreuses émergentes avant les essais cliniques humains. Le manque de disponibilité des systèmes de culture pour les tissus cardiaques humains qui est fonctionnellement et structurellement viable pour plus de 24 h est un facteur limitant pour des tests de cardiotoxicité fiables. Par conséquent, il est urgent de développer un système fiable pour la culture des tissus cardiaques humains dans des conditions physiologiques pour tester la toxicité des médicaments.
Le récent mouvement vers l’utilisation de cardiomyocytes pluripotents induits par les cellules souches induites par l’homme (smS-h) dans les tests de cardiotoxicité a fourni une solution partielle pour résoudre ce problème; cependant, la nature immature des hiPSC-CMs et la perte d’intégrité tissulaire par rapport à la nature multicellulaire du tissu cardiaque sont des limites majeures de cette technologie4. Une étude récente a partiellement surmonté cette limitation par la fabrication de tissus cardiaques à partir de hiPSC-CMs sur les hydrogels et les soumettant à une augmentation progressive de la stimulation électrique au fil du temps5. Cependant, leurs propriétés électromécaniques n’ont pas atteint la maturité vue dans le myocarde humain adulte. En outre, le tissu cardiaque est structurellement plus compliqué, étant composé de divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les neurones et divers types de fibroblastes stromal liés avec un mélange très spécifique de protéines de matrice extracellulaire6. Cette hétérogénéité de la population cellulaire non cardiomyocyte7,8,9 dans le cœur adulte de mammifères est un obstacle majeur dans la modélisation des tissus cardiaques en utilisant des types individuels de cellules. Ces limitations majeures soulignent l’importance de développer des méthodes pour permettre la culture du tissu cardiaque intact pour des études optimales impliquant des conditions physiologiques et pathologiques du cœur5.
La culture des tranches de cœur humain est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire 3D complet qui est similaire au tissu cardiaque humain qui pourrait refléter de façon fiable les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Cependant, son utilisation a été sévèrement limitée par la courte période de viabilité dans la culture, qui ne s’étend pas au-delà de 24 h en utilisant les protocoles les plus robustes signalés jusqu’en 201810,11,12. Cette limitation était due à de multiples facteurs, y compris l’utilisation de l’interface air-liquide pour la culture des tranches, et l’utilisation d’un simple milieu de culture qui ne supporte pas les exigences énergétiques élevées du tissu cardiaque. Nous avons récemment développé un système de culture submergé qui est en mesure de fournir une stimulation électrique continue et optimisé les composants des médias de la culture pour garder les tranches de tissu cardiaque viables pour un jusqu’à 6 jours13. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigus pour combler l’écart entre les résultats précliniques et cliniques d’essais. Dans l’article actuel, nous détaillant le protocole pour trancher et se poursier les tranches de coeur à l’aide d’un cœur de porc à titre d’exemple. Le même processus s’applique aux cœurs humains, aux chiens, aux moutons ou aux chats. Avec ce protocole, nous espérons diffuser la technologie à d’autres laboratoires de la communauté scientifique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

De nombreux nouveaux médicaments échouent dans les études cliniques en raison d’effets secondaires cardiotoxiques que les essais in vitro actuellement disponibles et les modèles animaux in vivo mal prédire les responsabilités cardiaques humaines, posant un fardeau de plusieurs milliards de dollars sur l’industrie pharmaceutique. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait dans le monde entier de meilleures approches pour identifier la cardiotoxicité des médicaments avant d’entreprendre des essais coûteux et longs « d’abord chez l’homme ». À l’heure actuelle, seules les cellules cardiaques immatures (cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [hiPSC-CMs]) sont utilisées pour tester l’efficacité thérapeutique et la toxicité des médicaments, car elles sont les seules cellules cardiaques humaines qui peuvent être cultivées pendant de longues périodes. pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments. Cependant, un type de cellule unique ne peut pas reproduire le phénotype du tissu cardiaque 3D complexe qui est formé de plusieurs types de cellules. Fait important, l’effet des médicaments doit être testé sur les cardiomyocytes adultes, qui ont des caractéristiques différentes et des réponses de toxicité par rapport aux hélico-CM immatures. Culturing tranches cardiaques humaines est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire complet qui imite le tissu cardiaque humain et reflète les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Récemment, grâce à l’optimisation des composantes des médias culturels et des conditions de culture pour inclure la stimulation électrique continue à 1,2 Hz et l’oxygénation intermittente du milieu de la culture, nous avons développé une nouvelle configuration du système culturel qui préserve la viabilité et la fonctionnalité des tranches de cœur humain et porcine pendant 6 jours dans la culture. Dans le protocole actuel, nous détail faisons part de la méthode de découpe et de culture du cœur de porc. Le même protocole est utilisé pour la culture des tranches de cœurs humains, de chiens, de moutons ou de chats. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigu qui comble l’écart entre les résultats des tests précliniques et cliniques.

À l’aide d’un stimulateur électrique de culture cellulaire disponible dans le commerce qui peut accueillir huit 6 plaques de puits à la fois, nous avons imité le milieu cardiaque adulte en induisant la stimulation électrique à la fréquence physiologique (1,2 Hz), et examiné pour les composants moyens fondamentaux pour prolonger la durée des tranches fonctionnelles de coeur de porc dans la culture13. Puisque le porc et les coeurs humains sont semblables...

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Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Ce protocole décrit comment trancher et culturer le tissu cardiaque dans des conditions physiologiques pendant 6 jours. Ce système de culture pourrait être utilisé comme une plate-forme pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies d’insuffisance cardiaque ainsi que des tests fiables de cardiotoxicité aigue dans un modèle cardiaque 3D.

Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Ce protocole est pour trancher et culturer des sections de tissu cardiaque pendant six jours dans des conditions physiologiques qui peuvent être employées pour l’essai aigu de toxicité cardiaque aussi bien que l’efficacité d’essai des thérapies d’arrêt du coeur. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle in situ humain prédictif pour les tests de toxicité cardiaque aiguë qui comblera l’écart entre les résultats des essais précliniques et cliniques. Qinghui Qu, un directeur de laboratoire de notre laboratoire, démontrera les procédures.Pour obtenir des tranches de tissu cardiaque de porc, ajoutez d’abord de la glace à la veste de refroidissement du bain de tissu d’un vibratome et ajoutez la solution Tyrode au bain. Utilisez un bocal en plastique d’un litre pour recueillir le ruissellement de glace fondue de la veste de refroidissement de bain de tissu et transférer le coeur de porc à un plateau contenant un litre de solution cardioplégique froide fraîche dans une armoire de biosécurité. Utilisez des scalpels stériles rétractables pour disséquer le cœur pour isoler le ventricule gauche et utiliser des lames de rasoir rectangulaires pour couper le ventricule gauche en blocs d’un à deux centimètres cubes.Réserver un bloc tissulaire pour le tranchage et placer les morceaux restants de bloc de tissu dans un tube de 50 millilitres de solution tyrode froide sur la glace. Masser délicatement le bloc de tissu réservé et ajouter une à deux gouttes de colle tissulaire au porte-échantillon métallique du vibratome. Collez un morceau de bloc d’agar de 4% avec une surface d’environ un centimètre carré à la colle et ajoutez une à deux gouttes de colle de tissu à l’agar.Attachez le bloc cardiaque au côté épidardium cardiaque d’agar vers le bas avec le tissu aussi plat contre le support que possible et placez le support de tissu avec le bloc de coeur dans le bain de tranchement du vibratome. Il est crucial de coller le bloc cardiaque à l’agar avec le côté épidardium cardiaque face vers le bas sur la colle tissulaire et de s’assurer que le tissu est aussi plat que possible. Attachez ensuite le tube d’oxygène au bain de tranchage et au plateau métallique rempli de solution Tyrode et placez 40 passoires à cellules micromètres sur le plateau métallique pour recueillir les sections des tissus cardiaques au fur et à mesure qu’elles sont tranchées.Utilisez le logiciel d’exploitation vibratome pour ajuster la hauteur de la lame et de l’échantillon de sorte que la lame est proche du haut du tissu, mais en dessous des muscles papillaires et le liquide couvre le tissu et la lame. Sélectionnez avance pour ajuster où commencer à trancher le tissu. Appuyez sur la tranche pour augmenter la vitesse et utilisez le bouton pour déplacer la lame vers le bord du tissu.Appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et avancer pour inactiver le processus. Ajustez ensuite les paramètres de coupe indiqués et pressez la tranche pour commencer à trancher le tissu. Lorsque la lame atteint l’extrémité du tissu, mais avant qu’elle n’atteigne l’extrémité du porte-spécimen, appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et appuyer sur le retour pour revenir à la position de départ.Lorsque les tranches atteignent toute la longueur et semblent être de bonne qualité, utilisez une pipette Pasteur en plastique remplie de solution tyrode froide pour recueillir doucement le tissu du bain à l’aide de forceps et ciseaux de printemps pour disloquer la tranche du cœur si nécessaire. Placez chaque tranche recueillie dans une passoire à cellules unique dans le bain tyrode oxygéné et utilisez la solution dans la pipette pour presser le tissu sur la surface de la passoire cellulaire. Placez ensuite une laveuse métallique sur le dessus du tissu pour la retenir.Après au moins une heure dans la solution tyrode oxygénée, couper l’extérieur de chaque tranche pour enlever les bords inégaux et coller l’extrémité de chaque tranche sur un morceau de six millimètres de large de la ceinture de synchronisation de l’imprimante en polyuréthane stérilisée avec des fils métalliques intégrés. Placez les tranches de cœur soutenues dans des plaques de six puits contenant six millilitres de milieu de culture par puits et utilisez des forceps stériles pour vous assurer que le tissu est au centre du puits. Faites en sorte que le couvercle de la plaque ne touche pas le tissu et placez la plaque sur la plaque de culture de sorte que le côté incurvé de la couverture de plaque corresponde avec le côté incliné de la plaque et que les coins carrés s’alignent.Placer les tranches dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de dioxyde de carbone. Remplacez les supernatants de culture par six millilitres de culture fraîche oxygénée trois fois par jour. Connectez le couvercle au stimulateur électrique de culture cellulaire et ajustez le stimulateur pour fournir en continu 10 volts d’électricité et une fréquence de 1,2 hertz aux tranches cardiaques.Après avoir branché la stimulation, les tranches cardiaques commenceront à battre. Tous les jours pendant le changement de milieu de midi, remplacez la couverture de plaque de stimulation du plat de culture pour empêcher la libération des particules toxiques de graphite dans le milieu de culture. Insérez le bouchon de mousse blanche où le couvercle utilisé se connecte au câble pour le stimulateur électrique de culture cellulaire afin d’éviter les dommages causés par l’eau au circuit électrique et placez le couvercle de la plaque dans un bain d’eau autoclavée complété par un antibiotique/antimycotique 2X.Le lendemain, décontaminer le couvercle de la plaque dans un bain à 70% d’éthanol pendant cinq à 15 minutes avant de transférer le couvercle dans un bain d’eau fraîche autoclavé complété par 2X antibiotique / antimycotique pendant trois minutes. Après le rinçage du couvercle de la plaque, utilisez un lingette propre sans peluche pulvérisée à l’éthanol pour enlever l’eau résiduelle des pièces en plastique et enlever le bouchon de mousse blanche. Le couvercle est alors prêt à être remis dans la plaque de culture.En utilisant cette nouvelle configuration de culture biomimétique comme démontré, la viabilité des tranches de coeur de porc a été maintenue pendant six jours tel qu’évalué par l’essai de MTT. Dans les six premiers jours, semblables aux réponses observées pour les tranches fraîches de coeur, il n’y a aucun transitoire spontané de calcium dans les cardiomyocytes de tranche de coeur de porc. Les cardiomyocytes ont répondu à la stimulation électrique et bêta-adrénergique externe.En outre, la force contractile et les réponses à l’isoproterenol ont été maintenues dans la culture de tranche de coeur pendant jusqu’à six jours semblables à celle observée dans les tranches fraîches de coeur. Plusieurs évaluations structurelles et fonctionnelles peuvent être effectuées sur les tranches cardiaques, y compris les tests de viabilité du MTT, l’immunostaining, la microscopie électronique, les mesures transitoires du calcium, les évaluations des fonctions contractiles, les évaluations métaboliques et l’analyse. Nous utilisons actuellement ce système de culture pour tester la toxicité cardiaque aiguë et l’efficacité des médicaments et des thérapies géniques d’intérêt pour les tranches de porc et de cœur humain.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR Spectroscopy

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Recherche

Médecine

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