Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM wird durch den NIH-Zuschuss P30GM127607 und den Zuschuss der American Heart Association 16SDG29950012 unterstützt. RB wird von P01HL78825 und UM1HL113530 unterstützt.

Alle tierischen Verfahren entsprachen den institutionellen Leitlinien der University of Louisville und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung für das Schneiden (ein Tag vor dem Schneiden)
<ol><li>Vorbereitung des vibrierenden Mikrotomes
	<ol>
<li>Legen Sie die Keramikklinge in ihren Halter, indem Sie diese Schritte befolgen: Nachdem Sie die Klinge sorgfältig ausgepackt haben, legen Sie die scharfe Kante zuerst in den Schlitz des K...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Hier beschreiben wir das detaillierte Videoprotokoll für unsere kürzlich veröffentlichte Methode für vereinfachten Mittleren Durchsatz (Prozesse bis zu 48 Slices/Gerät), die die Kultur von Schweineherzscheiben für einen Zeitraum ermöglicht, der ausreichend lang ist, um die akute Kardiotoxizität zu testen13. Die vorgeschlagenen Bedingungen imitieren die Umgebung des Herzens, einschließlich der Häufigkeit der elektrischen Stimulation, der Verfügbarkeit von Nährstoffen und der intermittie...

Drogeninduzierte Kardiotoxizität ist eine Hauptursache für Marktentzug1. Im letzten Jahrzehnt des20. Jahrhunderts wurden acht nicht-kardiovaskuläre Medikamente vom Markt genommen, da sie zu einem plötzlichen Tod aufgrund ventrikulärer Arrhythmienführten 2. Darüber hinaus können mehrere Anti-Krebs-Therapien (während in vielen Fällen wirksam) zu mehreren kardiotoxischen Wirkungen führen, einschließlich Kardiomyopathie und Arrhythmien. Beispielsweise können sowohl traditionelle (z. B. Anthracycline und Strahlung) als auch gezielte (z. B. Trastuzumab) Brustkrebstherapien bei einer Teilmenge von Patienten zu kardiovaskulären Komplikationen führen3. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Kardiologen und Onkologen (über das entstehende Feld der "Kardio-Onkologie") hat dazu beigetragen, dass diese Komplikationen überschaubar sind, um sicherzustellen, dass Patienten effektiv behandelt werden können2. Weniger klar sind die kardiovaskulären Wirkungen neuerer Wirkstoffe, einschließlich Her2- und PI3K-Inhibitoren, insbesondere wenn Therapien in Kombination eingesetzt werden. Daher besteht ein wachsender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien für kardiovaskuläre Toxizitäten im Zusammenhang mit aufkommenden Krebstherapien vor klinischen Studien am Menschen. Die mangelnde Verfügbarkeit von Kultursystemen für menschliches Herzgewebe, das für mehr als 24 h funktionell und strukturell tragfähig ist, ist ein begrenzender Faktor für zuverlässige Kardiotoxizitätstests. Daher ist es dringend notwendig, ein zuverlässiges System zur Kultivierung menschlichen Herzgewebes unter physiologischen Bedingungen für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität zu entwickeln.
Der jüngste Schritt hin zur Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) in Kardiotoxizitätstests hat eine partielle Lösung zur Lösung dieses Problems geliefert; jedoch sind die Unreife Natur der hiPSC-CMs und der Verlust der Gewebeintegrität im Vergleich zur mehrzelligen Natur des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Technologie4. Eine aktuelle Studie hat diese Einschränkung teilweise überwunden, indem herzgewebe von hiPSC-CMs auf Hydrogelen hergestellt und sie im Laufe der Zeit einer allmählichen Zunahme der elektrischen Stimulation ausgesetzt wurden5. Ihre elektromechanischen Eigenschaften erreichten jedoch nicht die Reife, die im erwachsenen menschlichen Myokard beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Herzgewebe strukturell komplizierter, da es aus verschiedenen Zelltypen besteht, darunter Endothelzellen, Neuronen und verschiedene Arten von stromalen Fibroblasten, die mit einer sehr spezifischen Mischung von extrazellulären Matrixproteinen verbunden sind6. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Zellpopulation7,8,9 im erwachsenen Säugetierherz ist ein großes Hindernis bei der Modellierung von Herzgewebe mit einzelnen Zelltypen. Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden, um kultur des intakten Herzgewebes für optimale Studien mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des Herzens zu ermöglichen5.
Das Kultivieren menschlicher Herzscheiben ist ein vielversprechendes Modell für intaktes menschliches Myokard. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten 3D-Multizellularsystem, das dem menschlichen Herzgewebe ähnelt und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards zuverlässig widerspiegeln könnte. Jedoch, seine Verwendung wurde stark durch die kurze Zeit der Lebensfähigkeit in der Kultur begrenzt, die nicht über 24 h mit den robustesten Protokollen bis 2018berichtet 10,11,12. Diese Einschränkung war auf mehrere Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Verwendung von Luft-Flüssig-Schnittstelle, um die Scheiben zu kulturieren, und die Verwendung eines einfachen Kulturmediums, das die hohen energetischen Anforderungen des Herzgewebes nicht unterstützt. Wir haben vor kurzem ein Unterwasserkultursystem entwickelt, das in der Lage ist, kontinuierliche elektrische Stimulation zu bieten und die Kulturmedienkomponenten optimiert, um Herzgewebescheiben lebensfähig für bis zu 6 Tage13zu halten. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, um die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen zu schließen. Im aktuellen Artikel beschreiben wir das Protokoll zum Schneiden und Kultivieren der Herzscheiben am Beispiel eines Schweineherzens. Das gleiche Verfahren wird auf Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen angewendet. Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Technologie auf andere Laboratorien in der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu verbreiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Viele neuartige Medikamente scheitern in klinischen Studien an kardiotoxischen Nebenwirkungen, da die derzeit verfügbaren In-vitro-Assays und In-vivo-Tiermodelle die menschlichen Herzverbindlichkeiten schlecht vorhersagen, was eine milliardenschwere Belastung für die pharmazeutische Industrie darstellt. Daher besteht weltweit ein weltweit unerfüllter medizinischer Bedarf an besseren Ansätzen zur Identifizierung der Kardiotoxizität von Arzneimitteln, bevor kostspielige und zeitaufwändige "First in Man"-Studien durchgeführt werden. Derzeit werden nur unreife Herzzellen (menschliche induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten [hiPSC-CMs]) verwendet, um die therapeutische Effizienz und Arzneimitteltoxizität zu testen, da sie die einzigen menschlichen Herzzellen sind, die über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können. Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität zu testen. Ein einzelner Zelltyp kann jedoch nicht den Phänotyp des komplexen 3D-Herzgewebes replizieren, das aus mehreren Zelltypen besteht. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten an erwachsenen Kardiomyozyten getestet werden muss, die im Vergleich zu unreifen hiPSC-CMs unterschiedliche Eigenschaften und Toxizitätsreaktionen aufweisen. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten multizellulären System, das das menschliche Herzgewebe imitiert und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards widerspiegelt. Kürzlich haben wir durch die Optimierung der Kulturmedienkomponenten und der Kulturbedingungen, um eine kontinuierliche elektrische Stimulation bei 1,2 Hz und die intermittierende Sauerstoffversorgung des Kulturmediums einzubeziehen, ein neues Kultursystem-Setup entwickelt, das die Lebensfähigkeit bewahrt. und Funktionalität von Menschen- und Schweineherzscheiben für 6 Tage in der Kultur. Im aktuellen Protokoll beschreiben wir als Beispiel die Methode zum Schneiden und Kultivieren von Schweineherzen. Das gleiche Protokoll wird verwendet, um Scheiben von Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen zu kultiieren. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt.

Mit einem handelsüblichen elektrischen Zellkultur-Stimulator, der acht 6 Wellplatten gleichzeitig aufnehmen kann, emulierten wir das erwachsene Herzmilieu, indem wir elektrische Stimulation bei der physiologischen Frequenz (1,2 Hz) induzieren, und für die grundlegenden Mediumkomponenten abgeschirmt werden, um die Dauer funktioneller Schweineherzscheiben in Kultur13zu verlängern. Da Schweine- und Menschliche Herzen in Größe und Anatomie15</sup...

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Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Dieses Protokoll beschreibt, wie herzgewebe unter physiologischen Bedingungen für 6 Tage geschnitten und kultiviert werden kann. Dieses Kultursystem könnte als Plattform für die Prüfung der Wirksamkeit neuartiger Herzinsuffizienz-Therapeutika sowie als zuverlässige Spross enderatonie Tests der akuten Kardiotoxizität in einem 3D-Herzmodell verwendet werden.

Schneiden und Culieren von Schweineherzen unter physiologischen Bedingungen

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Dieses Protokoll dient zum Schneiden und Kultivieren von Herzgewebeabschnitten für sechs Tage unter physiologischen Bedingungen, die für akute Kartotoxizitätstests sowie zur Prüfung der Wirksamkeit von Herzinsuffizienztherapien verwendet werden können. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute kardiale Toxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt. Demonstriert die Verfahren wird Qinghui Qu, ein Laborleiter aus unserem Labor.Um Schweineherzgewebescheiben zu erhalten, fügen Sie zuerst Eis in die Gewebebade-Kühljacke eines Vibrames und Tyrode-Lösung in das Bad. Verwenden Sie ein ein Liter Plastikglas, um den geschmolzenen Eisablauf aus der Kühljacke des Gewebebades zu sammeln und das Schweineherz in ein Tablett mit einem Liter frischer, kardiver mittelsemitzenischer Lösung in einem Biosicherheitsschrank zu übertragen. Verwenden Sie versenkbare sterile Skalpelle, um das Herz zu sezieren, um den linken Ventrikel zu isolieren und verwenden Sie rechteckige Rasierklingen, um den linken Ventrikel in ein bis zwei Würfelzentimeterblöcke zu schneiden.Legen Sie einen Gewebeblock zum Schneiden beiseite und legen Sie die restlichen Gewebeblockstücke in ein 50-Milliliter-Rohr kalter Tyrode-Lösung auf Eis. Massieren Sie den reservierten Gewebeblock vorsichtig und fügen Sie dem Metallprobenhalter des Vibratome einen bis zwei Tropfen Gewebekleber hinzu. Stecken Sie ein Stück 4%Agar-Block mit einer Oberfläche von etwa einem Quadratzentimeter auf den Kleber und fügen Sie ein bis zwei Tropfen Gewebekleber auf den Agar.Befestigen Sie den Herzblock an der Agar-Herz-Epikardie-Seite mit dem Gewebe so flach wie möglich gegen den Halter und legen Sie den Gewebehalter mit dem Herzblock in das Schnittbad des Vibratome. Es ist wichtig, den Herzblock an den Agar mit der Herz-Epikardie-Seite nach unten auf den Gewebekleber zu kleben und sicherzustellen, dass das Gewebe so flach wie möglich ist. Befestigen Sie dann das Sauerstoffrohr am Schneidbad und am mit Tyrode-Lösung gefüllten Metalltablett und legen Sie 40 Mikrometer-Zellsiebe auf die Metallschale, um die Herzgewebeabschnitte zu sammeln, während sie in Scheiben geschnitten werden.Verwenden Sie die Vibratom-Bediensoftware, um die Höhe der Klinge und der Probe so einzustellen, dass die Klinge nahe an der Oberseite des Gewebes ist, aber unter den Papillarmuskeln und Flüssigkeit das Gewebe und die Klinge bedeckt. Wählen Sie Advance aus, um die Stelle anzupassen, an der das Gewebe zu schneiden beginnt. Drücken Sie die Scheibe, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, und verwenden Sie den Knopf, um die Klinge in Richtung der Kante des Gewebes zu bewegen.Drücken Sie erneut auf Slice, um den Vorgang zu stoppen und zu deaktivieren. Passen Sie dann die Schnittparameter wie angegeben an und drücken Sie die Scheibe, um mit dem Schneiden des Gewebes zu beginnen. Wenn die Klinge das Ende des Gewebes erreicht, aber bevor sie das Ende des Probenhalters trifft, drücken Sie erneut die Scheibe, um anzuhalten, und drücken Sie zurück, um zur Startposition zurückzukehren.Wenn die Scheiben die volle Länge erreichen und von guter Qualität zu sein scheinen, verwenden Sie eine Pasteur-Kunststoff-Pipette, die mit kalter Tyrode-Lösung gefüllt ist, um das Gewebe aus dem Bad vorsichtig mit Zangen und Federscheren zu sammeln, um die Scheibe bei Bedarf aus dem Herzen zu entfernen. Legen Sie jede gesammelte Scheibe in ein einzelnes Zellsieb im sauerstoffhaltigen Tyrode-Bad und verwenden Sie die Lösung in der Pipette, um das Gewebe auf die Zellsieboberfläche zu drücken. Legen Sie dann eine Metallscheibe auf die Oberseite des Gewebes, um es zu halten.Nach mindestens einer Stunde in sauerstoffhaltiger Tyrode-Lösung die Außenseite jeder Scheibe schneiden, um unebene Kanten zu entfernen und das Ende jeder Scheibe auf ein sechs Millimeter breites Stück sterilisierten Polyurethan-Drucker-Zahnriemen mit eingebetteten Metalldrähten zu kleben. Legen Sie die unterstützten Herzscheiben in sechs-Well-Platten mit sechs Milliliter Kulturmedium pro Brunnen und verwenden Sie sterile Zangen, um sicherzustellen, dass das Gewebe in der Mitte des Brunnens ist. Achten Sie darauf, dass die Plattenabdeckung das Gewebe nicht berührt und die Platte auf die Kulturplatte aufgibt, so dass die gekrümmte Seite der Plattenabdeckung mit der abgewinkelten Seite der Platte übereinstimmt und sich die quadratischen Ecken anrichten.Legen Sie die Scheiben in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie die Kulturüberstandmittel dreimal täglich durch sechs Milliliter frisches sauerstoffreiches Kulturmedium. Schließen Sie die Abdeckung an den elektrischen Stimulator der Zellkultur an und stellen Sie den Stimulator so ein, dass er kontinuierlich 10 Volt Strom und eine 1,2-Hertz-Frequenz an die Herzscheiben liefert.Nach dem Einstecken der Stimulation beginnen die Herzscheiben zu schlagen. Jeden Tag während des Mittags-Medienwechsels die Stimulationsplattenabdeckung aus der Kulturschale ersetzen, um die Freisetzung giftiger Graphitpartikel in das Kulturmedium zu verhindern. Setzen Sie den weißen Schaumstoffstecker ein, an dem die verwendete Abdeckung mit dem Kabel für den elektrischen Stimulator der Zellkultur verbunden ist, um Wasserschäden am Stromkreis zu verhindern, und legen Sie die Plattenabdeckung in ein Bad aus autoklaviertem Wasser, das mit 2X Antibiotikum/Antimykotik ergänzt wird.Am nächsten Tag dekontaminieren Sie die Plattenabdeckung in einem 70%ethanol Bad für fünf bis 15 Minuten, bevor Sie die Abdeckung in ein frisches autoklavisches Wasserbad übertragen, das drei Minuten lang mit 2X Antibiotikum/Antimykotik ums Leben kam. Nach dem Spülen der Plattenabdeckung verwenden Sie ein mit Ethanol gesprühtes sauberes fusselfreies Tuch, um Restwasser aus den Kunststoffteilen zu entfernen und den weißen Schaumstoffstopfen zu entfernen. Die Abdeckung ist dann bereit, wieder in die Kulturplatte gelegt werden.Mit diesem neuen biomimetischen Kultur-Setup, wie gezeigt, Schweineherzscheiben Lebensfähigkeit wurde für sechs Tage beibehalten, wie durch MTT-Assay bewertet. In den ersten sechs Tagen, ähnlich wie bei frischen Herzscheiben, gibt es keine spontanen Kalziumtransienten in der Schweineherzscheibe Kardiomyozyten. Die Kardiomyozyten reagierten auf externe elektrische und beta-adrenerge Stimulation.Darüber hinaus wurden die kontraktile Kraft und die Reaktionen auf Isoproterenol in der Herzscheibenkultur für bis zu sechs Tage ähnlich der in frischen Herzscheiben beobachtet gehalten. An den Herzscheiben können mehrere strukturelle und funktionelle Bewertungen durchgeführt werden, einschließlich MTT-Lebensfähigkeitstests, Immunfärbung, Elektronenmikroskopie, Kalziumtransientenmessungen, kontraktilen Funktionsbewertungen, metabolischen Bewertungen und Analysen. Wir nutzen dieses Kultursystem derzeit, um die akute Kardialtoxizität und Wirksamkeit von Medikamenten und Gentherapien zu testen, die für Schweine- und menschliche Herzscheiben von Interesse sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Forschung

Medizin

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Reduktion der linksventrikulären Wandspannung und Verbesserung der Funktion in Failing Herzen mit Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Ein detailliertes Protokoll für physiologische Parameter Erfassung und Analyse bei neurochirurgischen kritische Patienten

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

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Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Eine Minimal-Invasive Modell Endochondral Frakturheilung bei Mäusen unter standardisierten Bedingungen biomechanische Analyse

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Funktionelle und physiologische Methoden zur Beurteilung der medianen Nervenregeneration in der Ratte

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...