Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM נתמך על ידי NIH מענק P30GM127607 ואיגוד הלב האמריקאי המענק 16SDG29950012. RB נתמכת על ידי P01HL78825 ו-UM1HL113530.

כל נוהלי החיות היו בהתאם להנחיות המוסדיים של אוניברסיטת לואיוויל ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש.
1. הכנה לפריסה (יום אחד לפני החיתוך)
<ol><li>הכנת מיקרוטומה הרוטטת
	<ol>
<li>הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזה?...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

כאן אנו מתארים את פרוטוקול וידאו מפורט עבור השיטה שפורסמה לאחרונה עבור תפוקה בינונית פשוטה (תהליכים עד 48 פרוסות/התקן) שיטה המאפשרת תרבות של פרוסות לב חזיר לתקופה ארוכה מספיק כדי לבדוק את הקרדיולקסיניטי החריפה13. התנאים המוצעים מחקים את הסביבה של הלב, כולל תדירות של גירוי חשמלי...

שיטת התרופות הנגרמת היא גורם מרכזי לגמילה משוק1. בעשור האחרון של המאהה -20, שמונה תרופות ללא לב וכלי דם הונסוגו מן השוק כתוצאה מכך מוות פתאומי בשל הפרעות קצב הלב2. בנוסף, מספר טיפולים נגד סרטן (בעוד במקרים רבים יעיל) יכול להוביל לכמה אפקטים cardiotoxic כולל שריר הלב הפרעות קצב. לדוגמה, הן מסורתיות (למשל, פחם וקרינה) ו ממוקד (g., trastuzumab) טיפולים סרטן השד יכול לגרום לסיבוכים לב וכלי דם בקבוצת משנה של חולים3. שיתוף פעולה קרוב בין קרדיולוגים ו אונקולוגים (באמצעות השדה המתעוררים של "סיבולת לב ריאה") עזר להפוך את הסיבוכים האלה לניהול להבטיח כי חולים יכולים להיות מטופלים ביעילות2. פחות ברור הם השפעות לב וכלי דם של סוכנים חדשים, כולל Her2 ו PI3K מעכבי, במיוחד כאשר הטיפולים משמשים בשילוב. לכן, יש צורך הולך וגדל אסטרטגיות ההקרנה הקדם קלינית עבור רעלים קרדיווסטיים הקשורים המתעוררים נגד סרטן טיפולים לפני ניסויים קליניים אנושיים. חוסר הזמינות של מערכות התרבות לרקמת הלב האנושית כי הוא פונקציונלי מבחינה מבנית עבור יותר מ -24 h הוא גורם מגביל עבור בדיקות הקרדיולוקסיטי אמין. לכן, יש צורך דחוף לפתח מערכת אמינה עבור רקמת לב האדם culturing בתנאים פיזיולוגיים לבדיקת רעילות לסמים.
המהלך האחרון לקראת השימוש של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע-הקרדיוציטים (היפנוטית-CMs) בבדיקות קרדיולוקסיטי סיפקה פתרון חלקי לטיפול בבעיה זו; עם זאת, הטבע בוגר של היפנוsc-CMs ואובדן שלמות רקמות בהשוואה לטבע רב-תאי של רקמת הלב הם מגבלות גדולות של טכנולוגיה זו4. מחקר שנערך לאחרונה התגבר באופן חלקי על מגבלה זו באמצעות הייצור של רקמות לב מ-היפרsc-CMs על הידרוג ' לים והוא החזיק אותם לעלייה הדרגתית גירוי חשמלי לאורך זמן5. עם זאת, התכונות האלקטרו-מכאני שלהם לא השיגו את הבגרות הנתפסת בשריר הלב האנושי המבוגר. יתר על כן, רקמת הלב הוא מורכב יותר מבחינה מבנית, להיות מורכב מסוגי תאים שונים כולל תאים אנדותל, נוירונים וסוגים שונים של מסטרומה פיברותקיעות מקושרים יחד עם תערובת ספציפית מאוד של חלבונים מטריתאיים מטריצות6. הטרוגניות הזאת של אוכלוסיית התאים הבלתי-קרדיוציט7,8,9 בליבו של היונקים הגדולים הוא מכשול משמעותי ברקמת לב מידול באמצעות סוגי תאים נפרדים. מגבלות גדולות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות להפיכת התרבות של רקמת לב שלמה למחקרים אופטימליים הכרוכים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב5.
מודל מבטיח של שריר הלב. האנושי ללא פגע טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מלאה 3D הרב-תאיים הדומה לרקמת הלב האנושי אשר יכול באופן מהימן לשקף את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. עם זאת, השימוש שלו כבר מוגבל באופן חמור על ידי התקופה הקצרה של הכדאיות בתרבות, אשר לא להאריך מעבר 24 h באמצעות הפרוטוקולים החזקים ביותר שדווחו עד 201810,11,12. מגבלה זו הייתה בשל גורמים מרובים, לרבות השימוש בממשק נוזלי האוויר לתרבות הפרוסות, והשימוש במדיום תרבותי פשוט שאינו תומך בדרישות האנרגטיות הגבוהות של רקמת הלב. פיתחנו לאחרונה מערכת תרבות מתחת לגוף, אשר מסוגלת לספק גירוי חשמלי רציף ואופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות כדי לשמור פרוסות רקמות לב קיימא עד 6 ימים13. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה כדי לסגור את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני. במאמר הנוכחי, אנו מפרט את הפרוטוקול לחיתוך ולתפירה של פרוסות הלב באמצעות לב חזיר כדוגמה. אותו תהליך מוחל על לבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מקווים להפיץ את הטכנולוגיה למעבדות אחרות בקהילה המדעית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

תרופות הרומן הרבות להיכשל במחקרים קליניים בשל תופעות לוואי cardiotoxic כמו כיום זמין מחוץ לתחום במודלים בעלי חיים vivo לחזות התחייבויות לב האדם, פוזות נטל רב מיליארד דולר על תעשיית התרופות. לפיכך, יש צורך רפואי ברחבי העולם לגישות טובות יותר כדי לזהות קרדיולוקסיניטי סמים לפני התחייבות יקר זמן רב ' הראשון במבחנים של האדם. כיום, רק תאים לב בלתי מפותחים (האדם המושרה ביותר בתאי גזע הנגרמת על ידי מערכת החייאה) משמשים כדי לבדוק יעילות טיפולית רעילות הסמים כפי שהם היחידים בתאי הלב האנושיים שיכולים להיות מתורבתים לתקופות ממושכות נדרש כדי לבדוק את יעילות הסמים ואת הרעילות. עם זאת, סוג תא בודד אינו יכול לשכפל את הפנוטיפ של רקמת הלב 3D מורכבת אשר נוצרת של סוגי תאים מרובים. וחשוב מכך, השפעת הסמים צריכה להיבדק על הקרדיוציטים מבוגרים, שיש להם מאפיינים שונים ותגובות רעילות בהשוואה ל-היפנוסק-CMs בלתי-מפותח. הפרוסות של לב האדם מהווה מודל מבטיח של שריר הלב האנושי ללא פגע. טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מסחר מלאה המחקה את רקמת הלב האנושית ומשקפת את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. לאחרונה, באמצעות אופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות ותנאי התרבות לכלול גירוי חשמלי רציף ב 1.2 Hz ו חמצן לסירוגין של מדיום התרבות, פיתחנו התקנה חדשה של מערכת התרבות אשר שומרת על יכולת הקיום והפונקציונליות של פרוסות לב של אדם וחזיר למשך 6 ימים בתרבות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מפרט את השיטה לחיתוך לב חזיר מקולף כדוגמה. אותו פרוטוקול משמש גם לפרוסות תרבות מלבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה הסוגרת את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני.

באמצעות ממריץ מסחרי של תרבות התא הזמין מסחרית כי יכול להכיל שמונה 6 צלחות היטב בבת אחת, אנו לחיקוי של למבוגרים את הסביבה הלב על ידי גרימת גירוי חשמלי בתדר הפיזיולוגי (1.2 Hz), והוקרן עבור רכיבים בינוניים בסיסיים כדי להאריך את המשך של פרוסות לב של חזיר פונקציונלי בתרבות<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.

חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

פרוטוקול זה הוא עבור חיתוך ו culturing רקמת הלב קטעים במשך שישה ימים תחת תנאים פיזיולוגיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות רעילות לב חריפה, כמו גם בדיקת היעילות של טיפולים אי ספיקת לב. מערכת תרבות זו יש פוטנציאל להיות אדם חיזוי רב עוצמה במודל situ לבדיקות רעילות לב חריפה כי סוגר את הפער בין תוצאות בדיקות פרה קליניות קליניות. הדגמת ההליכים תהיה צ'ינגהוי קו, מנהל מעבדה מהמעבדה שלנו.כדי להשיג פרוסות רקמת לב חזיר, ראשית להוסיף קרח ז'קט קירור אמבטיה רקמה של רטט ולהוסיף פתרון Tyrode לאמבטיה. השתמש בצנצנת פלסטיק של ליטר אחד כדי לאסוף את נגר הקרח המומס ממעיל הקירור של אמבט הרקמות ולהעביר את לב החזיר למגש המכיל ליטר אחד של תמיסת קרדיו-plegic קרה טרייה בארון biosafety. השתמש אזמלים סטריליים נשלפים לנתח את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי ולהשתמש סכיני גילוח מלבניים לחתוך את החדר השמאלי לתוך אחד עד שני קוביות סנטימטר בלוקים.מניחים בצד בלוק רקמה אחד לחיתוך ומניחים את חתיכות בלוק הרקמה הנותרות לתוך צינור 50 מיליליטר של פתרון טירודה קר על קרח. לעסות בעדינות את בלוק הרקמה השמור ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמות למחזיק דגימת המתכת של הרטט. תקע חתיכה של בלוק 4%agar עם שטח פנים של כ סנטימטר מרובע אחד להדביק ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמה אגר.חבר את בלוק הלב לצד אפיקארדיום לב אגר למטה עם הרקמה שטוחה נגד המחזיק ככל האפשר ולהמקם את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב לתוך האמבטיה חיתוך של הרטט. זה חיוני כדי לתקוע את בלוק הלב אל אגר עם הצד אפיארדיום לב פונה כלפי מטה על דבק הרקמה כדי לוודא את הרקמה היא שטוחה ככל האפשר. לאחר מכן חבר את צינור החמצן לאמבט החותך ואת מגש המתכת המלא בתסכת טירודה והצב 40 מסנני תאים מיקרומטר על מגש המתכת כדי לאסוף את חלקי רקמת הלב כפי שהם פרוסים.השתמש בתוכנת ההפעלה vibratome כדי להתאים את גובה הלהב ואת המדגם, כך הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירים papillary ונוזל מכסה את הרקמה ואת הלהב. בחר מראש כדי להתאים היכן להתחיל חיתוך הרקמה. לחץ על פרוסה כדי להגביר את המהירות ולהשתמש ידית כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה.לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולהתקדם כדי לבטל את הפעלת התהליך. לאחר מכן להתאים את הפרמטרים חיתוך כפי שצוין ולחץ על פרוסה כדי להתחיל לחתוך את הרקמה. כאשר הלהב מגיע לקצה הרקמה אך לפני שהוא פוגע בקצה מחזיק הדגימה, לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולחץ לחזור למצב ההתחלה.כאשר הפרוסות מגיעות לאורך מלא נראה באיכות טובה, להשתמש פיפטה פסטר פלסטיק מלא פתרון טירודה קר לאסוף בעדינות את הרקמה מהאמבטיה באמצעות מדפים ומספריים האביב כדי לנטרל את הפרוסה מהלב לפי הצורך. מניחים כל פרוסה שנאסף מסננת תא יחיד באמבט Tyrode מחומצן ולהשתמש בתסגם פיפטה ללחוץ על הרקמה על פני מסננת התא. ואז למקם מכונת כביסה מתכת על החלק העליון של הרקמה להחזיק אותו.לאחר שעה אחת לפחות בתסרון Tyrode מחומצן, לקצץ את החלק החיצוני של כל פרוסה כדי להסיר את כל הקצוות אחידים להדביק את הקצה של כל פרוסה על חתיכה ברוחב שישה מילימטר של חגורת תזמון מדפסת פוליאוריתן מעוקרת עם חוטי מתכת מוטבעים. מניחים את פרוסות הלב הנתמכות לתוך שש בארות צלחות המכילות שישה מיליליטר של תרבות בינונית לבא ולהשתמש ממטרים סטריליים כדי לוודא כי הרקמה היא במרכז באר. יש לדאוג כי כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה ולה מניח את הצלחת על צלחת התרבות, כך הצד המעוקל של כיסוי הצלחת תואם עם הצד הזוויתי של הצלחת ואת הפינות המרובעות בשורה.מניחים את הפרוסות לתוך 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור. החלף את על-טבעי התרבות בשישה מיליליטר של תרבות מחומצנת טרייה שלוש פעמים ביום. חבר את הכיסוי לגירוי החשמלי של תרבות התאים והתאם את המגרר כדי לספק באופן רציף 10 וולט חשמל ותדר הרץ 1.2 לפרוסות הלב.לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום. כל יום במהלך שינוי התקשורת בצהריים, להחליף את כיסוי צלחת גירוי מצלחת התרבות כדי למנוע שחרור של חלקיקי גרפיט רעילים לתוך מדיום התרבות. הכנס את תקע הקצף הלבן שבו הכיסוי המשמש מתחבר לכבל עבור מגרה חשמלי תרבות התא כדי למנוע נזקי מים למעגל החשמלי ולמקם את כיסוי הצלחת לתוך אמבטיה של מים autoclaved בתוספת 2X אנטיביוטי / אנטימיקוטי.למחרת, לטהר את כיסוי הצלחת באמבט אתנול 70% במשך חמש עד 15 דקות לפני העברת הכיסוי לתוך אמבט מים autoclaved טרי בתוספת אנטיביוטיקה 2X / antimycotic במשך שלוש דקות. לאחר שטיפה של כיסוי הצלחת, השתמשו בניגוב נקי ללא מוך מרוסס באתנול כדי להסיר את כל שאריות המים מחלקי הפלסטיק ולהסיר את תקע הקצף הלבן. לאחר מכן העטיפה מוכנה להצבה חזרה לצלחת התרבות.באמצעות התקנה זו תרבות ביומימטית חדשה כפי שהודגם, הכדאיות פרוסות לב חזיר נשמר במשך שישה ימים כפי שהוערך על ידי MTT assay. בששת הימים הראשונים, בדומה לתגובות שנצפו לפרוסות לב טריות, אין ארעי סידן ספונטניים בתוך לב החזיר פרוסת קרדיומיוציטים. הקרדיומיוציטים הגיבו לגירוי חשמלי ובטא-אדרנרגי חיצוני.בנוסף, הכוח מתכווץ ותגובות isoproterenol נשמרו בתרבות פרוסת הלב עד שישה ימים דומים לזה שנצפה פרוסות לב טריות. ניתן לבצע מספר הערכות מבניות ותפקודיות על פרוסות הלב, כולל בדיקות כדאיות MTT, כשל חיסוני, מיקרוסקופ אלקטרונים, מדידות סידן ארעיות, הערכות תפקודית מתכווצים, הערכות מטבוליות וניתוח. אנו משתמשים כעת במערכת תרבות זו כדי לבדוק את רעילות לב חריפה ויעילות של תרופות וטיפולים גנטיים של עניין חזיר ופרוסות לב אנושי.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluorescence הדמיה של Biventricular מבודדת עבודה לבבות ארנב

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

ירידה במתח וול חדר שמאלי ושיפור בתפקוד בכישלון לבבות באמצעות Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

פרוטוקול מפורט עבור פרמטרים פיזיולוגיים של רכישת ניתוח בחולים קריטיים הנוירוכירורגית

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

שבלולי השרשה החזיר גיניאה

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

מודל פולשנית לניתוח שבר Endochondral ריפוי בעכברים בתנאים מתוקננים ביו-מכני

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

פונקציונלי ופיסיולוגי שיטות להערכת התחדשות העצב החציוני בחולדה

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...