Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM은 NIH 교부금 P30GM127607 및 미국 심장 협회 보조금 16SDG29950012에 의해 지원됩니다. RB는 P01HL78825 및 UM1HL113530에 의해 지원됩니다.

모든 동물 절차는 루이빌 대학의 제도적 지침에 따라 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 슬라이스 준비 (슬라이스 하루 전)
<ol><li>진동 마이크로토메의 제조
	<ol>
<li>다음 단계에 따라 세라믹 블레이드를 홀더에 넣습니다: 블레이드를 조심스럽게 래핑한 후 날카로운 모서리를 먼저 블레이드 도구의 슬롯에 넣습니다. 그런 다음 홀더의 팔에 있...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

여기서 우리는 급성 심장 독성을 테스트하기에 충분히 긴 기간 동안 돼지 심장 슬라이스의 배양을 가능하게 하는 단순화된 중간 처리량(최대 48개의 슬라이스/장치) 방법에 대한 우리의 최근 발표된 방법에 대한 상세한 비디오 프로토콜을 설명합니다13. 제안된 조건은 전기 자극의 주파수, 영양 가용성 및 간헐적인 산소화를 포함하여 심혼의 환경을 모방합니다. 우리는 우리의 생...

약물 유발 심장 독성은 시장 철수의 주요 원인1. 20세기의 마지막 십년간에서, 8개의 비 심장 혈관 약은 심실 부정맥 때문에 급격한 죽음의 결과로 시장에서 철회되었습니다2. 또한, 여러 항암 치료 (많은 경우에 효과적인 동안) 심근 증과 부정맥을 포함 하 여 여러 심장 독성 효과 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 전통적인(예를 들어, 안트라시클라인 및 방사선) 및 표적(예를 들어, 트라스투주맙) 유방암 요법은 환자의 서브세트에서 심혈관 합병증을 초래할 수있다 3. 심장 전문의와 종양 전문의 사이의 긴밀한 협력 ("심장 종양학"의 신흥 분야를 통해) 이러한 합병증을 효과적으로 치료 할 수 있도록 관리 할 수 있도록도움이되었습니다 2. Her2 및 PI3K 억제제, 특히 치료가 조합되어 사용될 때 새로운 제제의 심혈관 효과는 명확하지 않습니다. 따라서, 인간 임상 시험 이전에 새로운 항암 치료와 관련된 심혈관 독성에 대한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있다. 24시간 이상 기능적으로 그리고 구조적으로 실행 가능한 인간 심장 조직에 대한 배양 시스템의 가용성의 부족은 신뢰할 수 있는 심장 독성 테스트를 위한 제한 요소입니다. 따라서, 약물 독성 시험을 위한 생리적 조건 하에서 인간의 심장 조직을 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 시급하다.
최근 심장 독성 테스트에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)의 사용으로 의한 움직임은 이 문제를 해결하기 위한 부분적인 해결책을 제공하였다; 그러나, hiPSC-CM의 미성숙한 성질과 심장 조직의 다세포 성질에 비해 조직 무결성의 손실은 이 기술의 주요 한계이다4. 최근 연구는 하이드로겔에 hiPSC-CM에서 심장 조직의 제조를 통해 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 시간이 지남에 따라 전기 자극의 점진적 증가를 복종5. 그러나, 그들의 전기 기계적 특성은 성인 인간 심근에서 볼 수있는 성숙도를 달성하지 못했습니다. 더욱이, 심장 조직은 구조적으로 더 복잡하며, 내피 세포, 뉴런 및 세포외 기질 성질 섬유아세포의 다양한 유형을 포함하는 다양한 유형의 세포외 매트릭스 단백질의 매우 특이적인 혼합물과 함께 연결되고6. 이러한 비심근세포 세포 집단의 이질성은 성인 포유류 심장에서7,,8,,9가 개별 세포 유형을 이용하여 심장 조직을 모델링하는 데 큰 장애가 된다. 이러한 주요 제한 사항은 심장의 생리적 및 병리학적 조건을 포함하는 최적의 연구를 위해 손상되지 않은 심장 조직의 문화를 가능하게하는 방법 개발의 중요성을강조5.
인간의 심장 조각을 배양하는 것은 그대로 인간의 심근의 유망한 모델입니다. 이 기술은 인간 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 안정적으로 반영할 수 있는 인간의 심장 조직과 유사한 완전한 3D 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 그 사용은 2018년10,,11,,12까지보고된 가장 강력한 프로토콜을 사용하여 24시간 이상 연장되지 않는 배양물의 생존가능성의 짧은 기간에 의해 심각하게 제한되었다. 이러한 제한은 슬라이스를 배양하기 위한 공기-액체 인터페이스의 사용, 및 심장 조직의 높은 에너지 요구를 지원하지 않는 간단한 배양 배지의 사용 등 여러 요인에 기인하였다. 최근 연속적인 전기자극을 제공할 수 있는 침수배양시스템을 개발하고,13일까지심장조직슬라이스를 지속가능한 상태로 유지하기 위해 배양배지 성분을 최적화하였다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 해소하기 위해 급성 심독성 시험을 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다. 현재 기사에서는 돼지 심장을 예로 사용하여 심장 조각을 자르고 배양하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 인간, 개, 양 또는 고양이 의 마음에도 동일한 과정이 적용됩니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 과학 커뮤니티의 다른 실험실에 기술을 전파하기를 희망합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

많은 신규 약물은 현재 시험관내 분석 및 생체 내 동물 모델이 인간의 심장 부채를 제대로 예측하지 못하므로 심장 독성 부작용으로 인한 임상 연구에서 실패하여 제약 산업에 수십억 달러의 부담을 안겨주고 있습니다. 따라서, 비용이 많이 들고 시간 소모 '남자에서 처음' 예심을 착수하기 전에 약 심장 독성을 확인하기 위하여 더 나은 접근을 위한 세계적인 충족되지 않은 의학 필요가 있습니다. 현재, 만 미성숙 심장 세포 (인간 유도 만능 줄기 세포 파생 심근 세포 [hiPSC-CMs])는 장기간 배양 할 수있는 유일한 인간 심장 세포이기 때문에 치료 효율성과 약물 독성을 테스트하는 데 사용됩니다. 약물 효능 및 독성을 테스트하는 데 필요합니다. 그러나, 단일 세포 모형은 다중 세포 모형의 형성되는 복잡한 3D 심혼 조직의 표현형을 복제할 수 없습니다. 중요한 것은, 미성숙 hiPSC-CMs에 비해 다른 특성 과 독성 반응을 가진 성인 심근 세포에 약물의 효력이 시험될 필요가 있습니다. 이 기술은 인간의 심장 조직을 모방하고 인간의 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 반영하는 완전한 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 최근에는 배양 배지 성분의 최적화와 배양 배지의 연속적인 전기 자극을 포함하는 배양 조건의 최적화와 배양배지의 간헐적 산소화를 통해 생존력을 보존하는 새로운 배양 시스템 설정을 개발했습니다. 그리고 문화에서 6 일 동안 인간과 돼지 심장 조각의 기능. 현재 프로토콜에서는 돼지 심장을 잘라내고 배양하는 방법을 예로 들어 자세히 설명하고 있습니다. 동일한 프로토콜은 인간, 개, 양 또는 고양이 하트에서 조각을 배양하는 데 사용됩니다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심독성 검사를 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다.

시판되는 세포 배양 전기 자극기를 이용하여 8개의 웰 플레이트를 한 번에 수용할 수 있고, 생리적 주파수(1.2 Hz)에서 전기 자극을 유도함으로써 성인 심장 밀리유를 에뮬레이트하고, 배양13에서기능성 돼지 심장 슬라이스의 지속 기간을 연장하기 위해 근본적인 배지 성분에 대해 스크리닝하였다. 돼지와 인간의 마음은 크기와 해부학15가</sup...

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Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

이 프로토콜은 급성 심장 독성 검사뿐만 아니라 심부전 치료의 효능을 테스트하는 데 사용할 수있는 생리적 조건하에서 6 일 동안 심장 조직 섹션을 잘라내고 배분하기위한 것입니다. 이 배양 시스템은 임상 전 및 임상 테스트 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심장 독성 테스트를 위한 시투 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 매니저 인 칭후이 쿠 (Qinghui Qu)가 될 것입니다.돼지 심장 조직 조각을 얻으려면 먼저 진동의 조직 목욕 냉각 재킷에 얼음을 추가하고 욕조에 티로드 용액을 추가하십시오. 1리터 플라스틱 항아리를 사용하여 티슈 목욕 냉각 재킷에서 녹은 얼음 유출을 수집하고 돼지 심장을 생물 안전 캐비닛에 신선한 차가운 심근 용액 1 리터가 들어있는 트레이로 옮춥니다. 개폐성 멸균 메스를 사용하여 심장을 해부하여 왼쪽 심실을 분리하고 직사각형 면도날을 사용하여 왼쪽 심실을 1~2개의 큐브 센티미터 블록으로 자른다.슬라이스를 위한 하나의 티슈 블록을 따로 놓고 남은 티슈 블록 조각을 얼음 위에 차가운 티로드 용액50 밀리리터 튜브에 넣습니다. 예약된 티슈 블록을 부드럽게 마사지하고 진동의 금속 샘플 홀더에 1~2방울의 티슈 접착제를 추가합니다. 접착제에 약 1 평방 센티미터의 표면적으로 4 %의 천 블록을 붙이고 한천에 1 ~ 2 방울의 조직 접착제를 추가하십시오.심장 블록을 가능한 한 홀더에 평평하게 사용하여 천 심장 에피카르듐 측에 부착하고 심장 블록으로 조직 홀더를 진동의 슬라이스 목욕에 놓습니다. 심장 블록을 조직 접착제에 내려다보이는 심장 에피카르듐 측과 함께 한고에 붙이고 조직이 가능한 한 평평하다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 산소 튜브를 스티로데 액스로 채워진 슬라이스 욕조와 금속 트레이에 부착하고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 금속 트레이에 배치하여 슬라이스할 때 심장 조직 섹션을 수집합니다.진동 작동 소프트웨어를 사용하여 블레이드와 샘플의 높이를 조정하여 블레이드가 조직의 상단에 가깝지만 유두 근육 과 액체 가 조직과 블레이드를 덮고 있습니다. 조직을 자르기 시작하는 위치를 조정하려면 사전을 선택합니다. 속도를 높이기 위해 슬라이스를 누르고 노브를 사용하여 블레이드를 조직의 가장자리쪽으로 이동시킵니다.슬라이스를 다시 눌러 중지하고 진행하여 프로세스를 비활성화합니다. 그런 다음 표시된 대로 절단 매개 변수를 조정하고 슬라이스를 눌러 조직을 자르기 시작합니다. 블레이드가 조직의 끝에 도달하지만 표본 홀더의 끝에 도달하기 전에 다시 슬라이스를 눌러 다시 멈추고 다시 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.슬라이스가 전체 길이에 도달하고 좋은 품질의 것으로 보일 때, 부드럽게 필요한 심장에서 조각을 탈구하는 집게와 봄 가위를 사용하여 목욕에서 조직을 수집하기 위해 차가운 Tyrode 솔루션으로 채워진 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용합니다. 산소티로드 욕조의 단일 세포 스트레이너에 수집된 각 슬라이스를 놓고 파이펫의 용액을 사용하여 세포 스트레이너 표면의 조직을 누릅니다. 그런 다음 금속 와셔를 조직의 상단에 놓고 그것을 누를 수 있습니다.산소타이로드 용액에서 적어도 1시간 후, 각 슬라이스의 바깥쪽을 다듬어 고르지 못한 가장자리를 제거하고 각 슬라이스의 끝을 6mm 너비의 멸균 된 폴리우레탄 프린터 타이밍 벨트에 내장 된 금속 와이어가 내장 된 상태로 고정하십시오. 지원되는 심장 조각을 6밀리리터의 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트에 넣고 멸균 집게를 사용하여 조직이 우물의 중심에 있는지 확인합니다. 플레이트 커버가 조직을 만지지 않고 플레이트의 곡선면이 플레이트의 각진 측면과 일치하도록 플레이트 에 플레이트를 배치하고 사각형 모서리가 정렬되도록주의하십시오.슬라이스를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 넣습니다. 배양 슈퍼네이터를 하루에 세 번 신선한 산소 배양 배지의 6 밀리리터로 대체하십시오. 커버를 세포 배양 전기 자극기와 연결하고 자극기를 조정하여 10볼트의 전기와 1.2 헤르츠 주파수를 심장 슬라이스에 지속적으로 전달합니다.자극을 연결한 후 심장 조각이 박동하기 시작합니다. 매일 정오 의 미디어 변화 동안, 배양 접시에서 자극 플레이트 커버를 교체하여 독성 흑연 입자가 배양 배지로 방출되는 것을 방지한다. 사용된 커버가 전기 회로의 물 손상을 방지하기 위해 전기 자극기를 위해 케이블에 연결되는 흰색 폼 플러그를 삽입하고 플레이트 커버를 2X 항생제/항mycotic으로 보충된 오토클레이브 수의 목욕에 배치합니다.다음 날, 플레이트 커버를 70%에탄올 욕조에서 5~15분 동안 오염제거한 후 3분 동안 2X 항생제/항마이코틱으로 보충된 신선한 오토클레이브 수조로 커버를 옮기는 것입니다. 플레이트 커버를 헹구고, 에탄올 스프레이 클린 보풀 프리 와이프를 사용하여 플라스틱 부품의 잔류물을 제거하고 흰색 폼 플러그를 제거하십시오. 그런 다음 덮개를 배양 판에 다시 넣을 준비가 되었습니다.이 새로운 생체 모방 배양 설정을 사용하여, 돼지 심장 슬라이스 생존력은 MTT 분석에 의해 평가된 대로 6일 동안 유지되었습니다. 처음 6 일 동안, 신선한 심장 조각에 대 한 관찰 하는 응답과 유사, 돼지 심장 슬라이스 심근 세포 내에서 아무 자발적인 칼슘 과도. 심근세포는 외부 전기 및 베타 부전 자극에 반응했습니다.또한, 이소프로테레놀에 대한 수축력 및 반응은 신선한 심장 조각에서 관찰된 것과 유사한 최대 6일 동안 심장 슬라이스 배양에서 유지되었다. MTT 생존 가능성 분석, 면역 염색, 전자 현미경 검사, 칼슘 과도 측정, 수축 기능 평가, 신진 대사 평가 및 분석을 포함한 여러 구조적 및 기능적 평가가 심장 조각에서 수행될 수 있습니다. 우리는 현재 돼지와 인간의 심장 조각에 대한 관심의 급성 심장 독성및 약물 및 유전자 치료의 효능을 테스트하기 위해이 배양 시스템을 사용하고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

연구

의학

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Algisyl-LVR을 사용하여 마음을 실패의 기능에서 왼쪽 심실 벽 스트레스와 개선의 감소

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

생리 적인 매개 변수에 대 한 자세한 프로토콜 수집 및 신경외과 중요 한 환자 분석

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

기니 피그 달팽이 관 이식

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

쥐에서 중간 신경 재생을 평가하는 기능적 및 생리적 방법

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...