Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM støttes av NIH-stipendet P30GM127607 og American Heart Association stipend 16SDG29950012. RB støttes av P01HL78825 og UM1HL113530.

Alle dyreprosedyrer var i samsvar med de institusjonelle retningslinjene til University of Louisville og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse til kutting (en dag før kutting)
<ol><li>Tilberedning av vibrerende mikrotome
	<ol>
<li>Plasser det keramiske bladet i holderen ved å følge disse trinnene: Etter nøye å ha pakket bladet, plasser den skarpe kanten først inn i sporet på bladverktøyet. Deretter monterer du bladet i holderen ved ...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Her beskriver vi den detaljerte videoprotokollen for vår nylig publiserte metode for forenklet medium gjennomstrømning (prosesser opp til 48 skiver / enhet) metode som muliggjør kultur av gris hjerteskiver for en periode tilstrekkelig lang til å teste akutt kardiotoksisitet13. De foreslåtte forholdene etterligner hjertets miljø, inkludert hyppigheten av elektrisk stimulering, næringstilgjengelighet og intermitterende oksygenering. Vi tilskriver den langvarige levedyktigheten til hjerteskive...

Legemiddelindusert kardiotoksisitet er en viktig årsak til markedsuttak1. I det siste tiåret av20-tallet ble åtte ikke-kardiovaskulære legemidler trukket tilbake fra markedet da de resulterte i plutselig død på grunn av ventrikulære arytmier2. I tillegg kan flere anti-kreft behandlinger (mens i mange tilfeller effektiv) føre til flere kardiotoksiske effekter inkludert kardiomyopati og arytmier. For eksempel kan både tradisjonelle (f.eks. antracykliner og stråling) og målrettet (f.eks trastuzumab) brystkreftbehandling føre til kardiovaskulære komplikasjoner hos en undergruppe av pasienter3. Et nært samarbeid mellom kardiologer og onkologer (via det nye feltet av "kardio-onkologi") har bidratt til å gjøre disse komplikasjonene håndterbare for å sikre at pasientene kan behandles effektivt2. Mindre klare er kardiovaskulære effekter av nyere midler, inkludert Her2 og PI3K hemmere, spesielt når terapi brukes i kombinasjon. Derfor er det et økende behov for pålitelige prekliniske screeningstrategier for kardiovaskulærtoksisitet forbundet med nye anti-kreftbehandlinger før kliniske studier hos mennesker. Mangelen på tilgjengelighet av kultursystemer for menneskelig hjertevev som er funksjonelt og strukturelt levedyktig for mer enn 24 timer er en begrensende faktor for pålitelig kardiotoksisitetstesting. Derfor er det et presserende behov for å utvikle et pålitelig system for å kule menneskelig hjertevev under fysiologiske forhold for testing av legemiddeltoksisitet.
Den siste overgangen mot bruk av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) i kardiotoksisitetstesting har gitt en delvis løsning for å løse dette problemet; Imidlertid er den umodne naturen til hiPSC-CMs og tap av vevsintegritet sammenlignet med flercellet natur hjertevevet store begrensninger i denne teknologien4. En fersk studie har delvis overvunnet denne begrensningen gjennom fabrikasjon av hjertevev fra hiPSC-CMs på hydrogeler og utsette dem for gradvis økning i elektrisk stimulering over tid5. Imidlertid oppnådde deres elektromekaniske egenskaper ikke modenhet sett i det voksne menneskelige myokardiet. Videre er hjertevevet strukturelt mer komplisert, som består av ulike celletyper, inkludert endotelceller, nevroner og ulike typer stromal fibroblaster knyttet sammen med en svært spesifikk blanding av ekstracellulære matriseproteiner6. Denne heterogeniteten til den ikke-kardiomycytcellepopulasjonen7,8,9 i voksen pattedyrhjerte er et stort hinder for modellering av hjertevev ved hjelp av individuelle celletyper. Disse store begrensningene understreker viktigheten av å utvikle metoder for å muliggjøre kultur av intakt hjertevev for optimale studier som involverer fysiologiske og patologiske forhold i hjertet5.
Culturing menneskelige hjerte skiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett 3D flercellet system som ligner på det menneskelige hjertevevet som på en pålitelig måte kan gjenspeile de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Bruken har imidlertid vært sterkt begrenset av den korte perioden med levedyktighet i kultur, som ikke strekker seg utover 24 timer ved hjelp av de mest robuste protokollene rapportert før 201810,11,12. Denne begrensningen skyldtes flere faktorer, inkludert bruk av luftflytende grensesnitt for å dyrke skivene, og bruk av et enkelt kulturmedium som ikke støtter hjertevevets høye energiske krav. Vi har nylig utviklet et nedsenket kultursystem som er i stand til å gi kontinuerlig elektrisk stimulering og optimalisert kulturmediekomponentene for å holde hjertevevskiver levedyktigi opptil 6 dager13. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting for å lukke gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater. I den nåværende artikkelen beskriver vi protokollen for kutting og kuling av hjerteskiver ved hjelp av et grisehjerte som et eksempel. Den samme prosessen brukes på menneske,hund, sau eller kattehjerter. Med denne protokollen håper vi å spre teknologien til andre laboratorier i det vitenskapelige samfunnet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Mange nye legemidler mislykkes i kliniske studier på grunn av kardiotoksiske bivirkninger som for tiden tilgjengelig in vitro analyser og in vivo dyremodeller dårlig forutsi menneskelige hjertegjeld, utgjør en multi-milliard-dollar byrde på den farmasøytiske industrien. Derfor er det et verdensomspennende udekket medisinsk behov for bedre tilnærminger for å identifisere narkotika kardiotoksisitet før du foretar kostbart og tidkrevende "første i mennesket" studier. Foreløpig brukes bare umodne hjerteceller (humanindusertpluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter [hiPSC-CMs]) til å teste terapeutisk effektivitet og legemiddeltoksisitet, da de er de eneste menneskelige hjertecellene som kan dyrkes i lengre perioder nødvendig for å teste legemiddeleffekt og toksisitet. En enkelt celletype kan imidlertid ikke replikere fenotypen til det komplekse 3D-hjertevevet som er dannet av flere celletyper. Viktigere, effekten av narkotika må testes på voksne kardiomyocytter, som har forskjellige egenskaper og toksisitetsresponser sammenlignet med umodne hiPSC-CMs. Culturing menneskelige hjerteskiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett flercellet system som etterligner det menneskelige hjertevevet og gjenspeiler de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Nylig, gjennom optimalisering av kulturmediekomponenter og kulturforholdene for å inkludere kontinuerlig elektrisk stimulering på 1,2 Hz og intermitterende oksygenering av kulturmediet, utviklet vi et nytt kultursystemoppsett som bevarer levedyktighet og funksjonaliteten til menneske- og grisehjerteskiver i 6 dager i kulturen. I den nåværende protokollen beskriver vi metoden for kutting og kuling av grisehjerte som et eksempel. Den samme protokollen brukes til å dyrke skiver fra menneske, hund, sauer eller kattehjerter. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting som lukker gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater.

Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig cellekultur elektrisk stimulator som kan romme åtte 6 brønnplater samtidig, emulerte vi det voksne hjertemiljøet ved å indusere elektrisk stimulering ved fysiologisk frekvens (1,2 Hz), og screenet for de grunnleggende mellomstore komponentene for å forlenge varigheten av funksjonelle grishjerteskiver i kultur13. Siden gris og menneskelige hjerter er like i størrelse og anatomi15, utviklet vi et ...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Denne protokollen beskriver hvordan å skjære og kultur hjertevev under fysiologiske forhold i 6 dager. Dette kultursystemet kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye hjertesvikt terapeutiske samt pålitelig testing av akutt kardiotoksisitet i en 3D hjertemodell.

Slicing og culturing gris hjerter under fysiologiske forhold

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Denne protokollen er for kutting og dyrking av hjertevev seksjoner i seks dager under fysiologiske forhold som kan brukes til akutt hjertetoksisitet testing samt testing effekten av hjertesvikt terapi. Dette kultursystemet har potensial til å bli en kraftig prediktiv human in situ modell for akutt hjertetoksisitet testing som lukker gapet mellom pre-kliniske og kliniske testresultater. Å demonstrere prosedyrene vil være Qinghui Qu, en laboratorieleder fra laboratoriet vårt.For å få gris hjerte vev skiver, først legge is til vev bad kjølejakke av en vibratom og legge Tyrode løsning til badekaret. Bruk en en liters plastkrukke til å samle den smeltede isavrenning fra vevbadkjølejakken og overfør grisehjertet til et brett som inneholder en liter frisk kald kardioplegisk løsning i et biosikkerhetsskap. Bruk uttrekkbare sterile skalpeller for å dissekere hjertet for å isolere venstre ventrikkel og bruke rektangulære barberblad til å kutte venstre ventrikkel i en til to kube centimeter blokker.Sett til side en vevsblokk for kutting og legg de gjenværende vevsblokkbitene i et 50 milliliter rør med kald Tyrode-løsning på is. Masser forsiktig den reserverte vevsblokken og legg til en til to dråper vevlim til metallprøveholderen på vibratomen. Stikk et stykke 4% agarblokk med et overflateareal på omtrent en kvadratcentimeter til limet og legg til en til to dråper vevlim til agaren.Fest hjerteblokken til agar hjerte epicardium side ned med vevet så flatt mot holderen som mulig og plasser vevholderen med hjerteblokken inn i kuttbadet i vibratomen. Det er avgjørende å stikke hjerteblokken til agaren med hjerteeventardiumsiden vendt ned på vevlimet og for å sikre at vevet er så flatt som mulig. Fest deretter oksygenrøret til skjærebadet og metallbrettet fylt med Tyrode-løsning og legg 40 mikrometercellesiler på metallbrettet for å samle hjertevevsseksjonene når de er skiver.Bruk vibratomets driftsprogramvare til å justere høyden på bladet og prøven slik at bladet er nær toppen av vevet, men under papillære muskler og væske dekker vevet og bladet. Velg forhånd for å justere hvor vevet skal begynne å kuttes. Trykk på skiven for å øke hastigheten og bruk knotten til å bevege bladet mot kanten av vevet.Trykk stykke igjen for å stoppe og gå videre for å deaktivere prosessen. Juster deretter skjæreparametrene som angitt, og trykk på skiven for å begynne å kutte vevet. Når bladet når enden av vevet, men før det treffer enden av prøveholderen, trykker du på skiven igjen for å stoppe og trykk på gå tilbake for å gå tilbake til startposisjonen.Når skivene når full lengde og ser ut til å være av god kvalitet, bruk en plast Pasteur pipette fylt med kald Tyrode løsning for å forsiktig samle vevet fra badet ved hjelp av tang og vårsaks for å forskyve skiven fra hjertet etter behov. Legg hvert oppsamlede stykke i en enkelt cellesil i det oksygenerte Tyrode-badet og bruk oppløsningen i pipetten til å trykke vevet på cellesiloverflaten. Plasser deretter en metallvaske på toppen av vevet for å holde den nede.Etter minst en time i oksygenert Tyrode løsning, trim utsiden av hver skive for å fjerne eventuelle ujevne kanter og lim enden av hver skive på en seks millimeter bred stykke sterilisert polyuretan skriver timing belte med innebygde metallledninger. Plasser de støttede hjerteskivene i seksbrønnsplater som inneholder seks milliliter kulturmedium per brønn, og bruk sterile tang for å sikre at vevet er i midten av brønnen. Vær forsiktig så platedekselet ikke berører vevet og plasser platen på kulturplaten slik at den buede siden av platedekselet passer sammen med den vinklede siden av platen og at de firkantede hjørnene linje opp.Legg skivene i en 37 graders Celsius og 5% karbondioksid inkubator. Erstatt kultursupernativa med seks milliliter frisk oksygenert kultur medium tre ganger per dag. Koble dekselet til cellekulturen elektrisk stimulator og juster stimulatoren for å kontinuerlig levere 10 volt elektrisitet og en 1,2 hertz frekvens til hjerteskiver.Etter plugging i stimuleringen, vil hjerteskivene begynne å slå. Hver dag i løpet av middagsmedieskiftet, skift stimuleringsplatedekselet fra kulturfatet for å forhindre frigjøring av giftige grafittpartikler inn i kulturmediet. Sett inn den hvite skumpluggen der det brukte dekselet kobles til kabelen for cellekulturen elektrisk stimulator for å forhindre vannskader på den elektriske kretsen og plasser platedekselet i et bad med autoklavet vann supplert med 2X antibiotika / antimykotisk.Neste dag, dekontaminere platedekselet i et 70% etanolbad i fem til 15 minutter før du overfører dekselet til et friskt autoklavet vannbad supplert med 2X antibiotika / antimykotisk i tre minutter. Etter skylling av platedekselet, bruk en etanolsprøytet ren lofri klut for å fjerne restvann fra plastdelene og fjerne den hvite skumpluggen. Dekselet er da klart til å plasseres tilbake i kulturplaten.Ved hjelp av dette nye biomimetiske kulturoppsettet som demonstrert, ble grisehjerteskiver levedyktighet opprettholdt i seks dager vurdert av MTT-analysen. I de første seks dagene, i likhet med svarene observert for friske hjerteskiver, er det ingen spontane kalsiumtransienter i grisens hjerteskiver. Kardiomyocytene reagerte på ekstern elektrisk og beta-adrenerge stimulering.I tillegg ble kontraktil kraft og svar på isoproterenol opprettholdt i hjerteskivekultur i opptil seks dager lik den som ble observert i friske hjerteskiver. Flere strukturelle og funksjonelle vurderinger kan utføres på hjerteskiver, inkludert MTT levedyktighetsanalyser, immunstaining, elektronmikroskopi, kalsiumtransientmålinger, kontraktile funksjonsvurderinger, metabolske vurderinger og analyse. Vi bruker for tiden dette kultursystemet til å teste akutt hjertetoksisitet og effekt av legemidler og genterapi av interesse for gris og menneskelige hjerteskiver.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluorescens Imaging av isolerte Biventricular Arbeide Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardial Cell Levering: Observasjoner i murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

En detaljert protokoll for fysiologiske parametre oppkjøp og analyse i Neurosurgical kritisk pasienter

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Cochlea implantasjon i marsvin

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

En minimal invasiv modell for å analysere Endochondral brudd i mus Under standardisert biomekaniske forhold

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Funksjonelle og fysiologiske metoder for evaluering av median nerveregenerering i rotten

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optocardiography og elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-perfusert Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...