Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

O TMAM é apoiado pelo subsídio NIH P30GM127607 e pela American Heart Association 16SDG29950012. RB é suportado por P01HL78825 e UM1HL113530.

Todos os procedimentos animais foram de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Louisville e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
1. Preparação para o corte (um dia antes do corte)
<ol><li>Preparação do microtome vibratório
	<ol>
<li>Coloque a lâmina de cerâmica no suporte seguindo estas etapas: depois de desembrulhar cuidadosamente a lâmina, coloque a borda afiada primeiro na ranhura da ferramenta da lâmina. Em segui...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Aqui descrevemos o protocolo de vídeo detalhado para o nosso método recém-publicado para o método de throughput médio simplificado (processos de até 48 fatias/dispositivo) que permite a cultura de fatias de coração de porco por um período suficientemente longo para testar cardiotoxicidade aguda13. As condições propostas imitam o ambiente do coração, incluindo frequência de estimulação elétrica, disponibilidade de nutrientes e oxigenação intermitente. Atribuímos a viabilidade pr...

A cardiotoxicidade induzida por drogas é uma das principais causas de retirada do mercado1. Na última década doséculo XX, oito drogas não cardiovasculares foram retiradas do mercado, pois resultaram em morte súbita por arritmias ventriculares2. Além disso, várias terapias anticancerígenas (embora em muitos casos eficazes) podem levar a vários efeitos cardiotóxicos, incluindo cardiomiopatia e arritmias. Por exemplo, tanto as terapias tradicionais (por exemplo, antrasicopas e radiação) quanto as terapias direcionadas (por exemplo, trastuzumabe) podem resultar em complicações cardiovasculares em um subconjunto de pacientes3. Uma estreita colaboração entre cardiologistas e oncologistas (através do campo emergente da "cardio-oncologia") ajudou a tornar essas complicações gerenciáveis garantindo que os pacientes possam ser tratados efetivamente2. Menos claros são os efeitos cardiovasculares de agentes mais novos, incluindo inibidores Her2 e PI3K, especialmente quando as terapias são usadas em combinação. Portanto, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis para toxicidades cardiovasculares associadas a terapias anticancerígenas emergentes antes de ensaios clínicos em humanos. A falta de disponibilidade de sistemas de cultura para tecido cardíaco humano que seja funcional e estruturalmente viável por mais de 24 h é um fator limitante para testes de cardiotoxicidade confiáveis. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um sistema confiável para a cultura do tecido cardíaco humano condições fisionicais para testar a toxicidade das drogas.
O recente movimento em direção ao uso de cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos (hiPSC-CMs) em testes de cardiotoxicidade forneceu uma solução parcial para resolver essa questão; no entanto, a natureza imatura dos hiPSC-CMs e a perda de integridade tecidual em comparação com a natureza multicelular do tecido cardíaco são grandes limitações desta tecnologia4. Um estudo recente superou parcialmente essa limitação através da fabricação de tecidos cardíacos de hiPSC-CMs em hidrogéis e submetendo-os ao aumento gradual da estimulação elétrica ao longo do tempo5. No entanto, suas propriedades eletromecânicas não atingiram a maturidade observada no miocárdio humano adulto. Além disso, o tecido cardíaco é estruturalmente mais complicado, sendo composto de vários tipos de células, incluindo células endoteliais, neurônios e vários tipos de fibroblastos estrônticos ligados a uma mistura muito específica de proteínas matrizes extracelulares6. Essa heterogeneidade da população de células não cardiomiócitos7,8,9 no coração de mamíferos adultos é um grande obstáculo na modelagem do tecido cardíaco usando tipos de células individuais. Essas principais limitações destacam a importância do desenvolvimento de métodos para permitir a cultura de tecido cardíaco intacto para estudos ideais envolvendo condições fisiológicas e patológicas do coração5.
Cultivar fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo que é semelhante ao tecido cardíaco humano que poderia refletir de forma confiável as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. No entanto, seu uso tem sido severamente limitado pelo curto período de viabilidade na cultura, que não se estende além de 24 h utilizando os protocolos mais robustos relatados até 201810,11,12. Essa limitação deveu-se a múltiplos fatores, incluindo o uso da interface ar-líquido para cultivar as fatias, e o uso de um meio de cultura simples que não suporta as altas demandas energéticas do tecido cardíaco. Recentemente desenvolvemos um sistema de cultura submerso que é capaz de fornecer estimulação elétrica contínua e otimizar os componentes da mídia cultural para manter as fatias de tecido cardíaco viáveis por até 6 dias13. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda para fechar a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos. No artigo atual, estamos detalhando o protocolo para cortar e cultivar as fatias do coração usando como exemplo um coração de porco. O mesmo processo é aplicado a corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Com este protocolo, esperamos espalhar a tecnologia para outros laboratórios da comunidade científica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Muitas drogas novas falham em estudos clínicos devido a efeitos colaterais cardiotóxicos como os ensaios in vitro disponíveis atualmente e modelos animais in vivo mal prevêem passivos cardíacos humanos, representando um fardo multibilionário para a indústria farmacêutica. Portanto, há uma necessidade médica não atendida mundial de melhores abordagens para identificar a cardiotoxicidade medicamentosa antes de realizar testes caros e demorados "primeiro no homem". Atualmente, apenas células cardíacas imaturas (cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos [hiPSC-CMs]) são usados para testar a eficiência terapêutica e a toxicidade das drogas, pois são as únicas células cardíacas humanas que podem ser cultivadas por períodos prolongados necessário para testar a eficácia e toxicidade da droga. No entanto, um único tipo de célula não pode replicar o fenótipo do complexo tecido cardíaco 3D que é formado por múltiplos tipos de células. É importante ressaltar que o efeito das drogas precisa ser testado em cardiomiócitos adultos, que têm características diferentes e respostas de toxicidade em comparação com os imaturos hiPSC-CMs. A combinação de fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular completo que imita o tecido cardíaco humano e reflete as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. Recentemente, através da otimização dos componentes da mídia cultural e das condições de cultura para incluir estimulação elétrica contínua a 1,2 Hz e oxigenação intermitente do meio de cultura, desenvolvemos uma nova configuração do sistema de cultura que preserva a viabilidade e funcionalidade de fatias de coração humano e porco por 6 dias na cultura. No protocolo atual, estamos detalhando o método para cortar e cultivar coração de porco como exemplo. O mesmo protocolo é usado para cultivar fatias de corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda que fecha a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos.

Usando um estimulador elétrico de cultura celular comercialmente disponível que pode acomodar oito 6 placas de poço de uma só vez, emulamos o meio cardíaco adulto induzindo estimulação elétrica na frequência fisiológica (1,2 Hz), e rastreamos os componentes médios fundamentais para prolongar a duração das fatias funcionais do coração de porco na cultura13. Como os corações de porco e humano são semelhantes em tamanho e anatomia15...

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Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Este protocolo descreve como cortar e cultivar tecido cardíaco condições fisiológicas por 6 dias. Este sistema de cultura poderia ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de novas terapêuticas de insuficiência cardíaca, bem como testes confiáveis de cardiotoxicidade aguda em um modelo de coração 3D.

Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Este protocolo é para cortar e culcular seções de tecido cardíaco por seis dias sob condições fisiológicas que podem ser usadas para testes agudos de toxicidade cardíaca, bem como testar a eficácia de terapias de insuficiência cardíaca. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo de humanos in situ para testes agudos de toxicidade cardíaca que fecha a lacuna entre os resultados pré-clínicos e clínicos de testes. Demonstrando os procedimentos estará Qinghui Qu, um gerente de laboratório do nosso laboratório.Para obter fatias de tecido do coração de porco, primeiro adicione gelo à jaqueta de resfriamento do banho de tecido de um vibratome e adicione a solução de Tyrode ao banho. Use um frasco de plástico de um litro para coletar o escoamento de gelo derretido da jaqueta de resfriamento do banho de tecido e transfira o coração de porco para uma bandeja contendo um litro de solução cardioplégica fria fresca em um armário de biossegurança. Use bisturis estéreis retráteis para dissecar o coração para isolar o ventrículo esquerdo e usar lâminas de barbear retangulares para cortar o ventrículo esquerdo em blocos de um a dois centímetros cubos.Reserve um bloco de tecido para cortar e coloque os pedaços restantes do bloco de tecido em um tubo de 50 mililitros de solução de Tyrode fria no gelo. Massageie suavemente o bloco de tecido reservado e adicione uma a duas gotas de cola de tecido ao suporte de amostra metálica do vibratome. Coloque um pedaço de bloco de 4% de ágar com uma área de superfície de aproximadamente um centímetro quadrado à cola e adicione uma a duas gotas de cola de tecido ao ágar.Conecte o bloco cardíaco ao lado do epicardium cardíaco de ágar para baixo com o tecido o mais plano possível contra o suporte e coloque o suporte do tecido com o bloco cardíaco no banho de corte do vibratome. É crucial colocar o bloco cardíaco no ágar com o lado epicardium cardíaco voltado para baixo na cola do tecido e para ter certeza de que o tecido é o mais plano possível. Em seguida, conecte o tubo de oxigênio ao banho de corte e à bandeja de metal cheia de solução de Tyrode e coloque 40 filtros de células de micrômetro na bandeja de metal para coletar as seções do tecido cardíaco à medida que são fatiadas.Use o software operacional vibratome para ajustar a altura da lâmina e a amostra para que a lâmina esteja perto da parte superior do tecido, mas abaixo dos músculos papilares e líquidos está cobrindo o tecido e a lâmina. Selecione o avanço para ajustar onde começar a cortar o tecido. Pressione a fatia para aumentar a velocidade e use o botão para mover a lâmina em direção à borda do tecido.Pressione a fatia novamente para parar e avançar para inativar o processo. Em seguida, ajuste os parâmetros de corte conforme indicado e pressione a fatia para começar a cortar o tecido. Quando a lâmina atingir a extremidade do tecido, mas antes de atingir a extremidade do suporte do espécime, pressione a fatia novamente para parar e pressione voltar para voltar à posição inicial.Quando as fatias atingirem o comprimento total e parecerem de boa qualidade, use uma pipeta pasteur de plástico cheia de solução de Tyrode fria para coletar suavemente o tecido do banho usando fórceps e tesouras de mola para deslocar a fatia do coração conforme necessário. Coloque cada fatia coletada em um único coador de células no banho de Tyrode oxigenado e use a solução na pipeta para pressionar o tecido na superfície do coador celular. Em seguida, coloque uma arruela de metal na parte superior do tecido para segurá-lo.Depois de pelo menos uma hora em solução de Tyrode oxigenada, corte o exterior de cada fatia para remover quaisquer bordas irregulares e cole a extremidade de cada fatia em um pedaço de seis milímetros de largura de correia de cronometragem de impressora poliuretano esterilizada com fios metálicos incorporados. Coloque as fatias de coração apoiadas em placas de seis poços contendo seis mililitros de cultura média por poço e use fórceps estéreis para se certificar de que o tecido está no centro do poço. Tome cuidado para que a tampa da placa não toque no tecido e coloque a placa sobre a placa de cultura de modo que o lado curvo da tampa da placa combine com o lado angular da placa e que os cantos quadrados se alinham.Coloque as fatias em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua os supernacantes culturais por seis mililitros de cultura oxigenada fresca três vezes por dia. Conecte a tampa ao estimulador elétrico da cultura celular e ajuste o estimulador para fornecer continuamente 10 volts de eletricidade e uma frequência de 1,2 hertz às fatias do coração.Depois de ligar a estimulação, as fatias do coração começarão a bater. Todos os dias durante a mudança de mídia do meio-dia, substitua a tampa da placa de estimulação do prato de cultura para evitar a liberação de partículas de grafite tóxico no meio da cultura. Insira o plugue de espuma branca onde a tampa usada se conecta ao cabo para o estimulador elétrico de cultura celular para evitar danos à água no circuito elétrico e coloque a tampa da placa em um banho de água autoclavada suplementada com antibiótico/antimíctico 2X.No dia seguinte, descontaminar a tampa da placa em um banho de 70% de etanol por cinco a 15 minutos antes de transferir a tampa para um banho de água autoclaved fresco complementado com antibiótico 2X/antimíctico por três minutos. Depois de enxaguar a tampa da placa, use um lenço limpo sem fiapos limpos pulverizado com etanol para remover qualquer água residual das partes plásticas e remover o plugue de espuma branca. A capa está então pronta para ser colocada de volta na placa de cultura.Utilizando esta nova configuração de cultura biomimética como demonstrado, a viabilidade das fatias de coração de porco foi mantida por seis dias, conforme avaliado pelo ensaio MTT. Nos primeiros seis dias, semelhante às respostas observadas para fatias de coração fresco, não há transitórios espontâneos de cálcio dentro dos cardiomiócitos de fatia de coração de porco. Os cardiomiócitos responderam à estimulação elétrica e beta-adrenérgica externa.Além disso, a força contratil e as respostas ao isoproterenol foram mantidas na cultura de fatias cardíacas por até seis dias semelhantes às observadas em fatias de coração fresco. Várias avaliações estruturais e funcionais podem ser realizadas nas fatias cardíacas, incluindo ensaios de viabilidade de MTT, imunostaining, microscopia eletrônica, medidas transitórias de cálcio, avaliações de funções contratuais, avaliações metabólicas e análises. Estamos atualmente usando este sistema cultural para testar a toxicidade cardíaca aguda e eficácia de drogas e terapias genéticas de interesse em fatias de porcos e corações humanos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

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Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Medicina

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Redução do Ventrículo Esquerdo de parede Estresse e Melhoria na função em falta Corações usando Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Um protocolo detalhado para parâmetros fisiológicos aquisição e análise em pacientes críticos neurocirúrgicos

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Implante coclear na cobaia

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

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The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...