Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM поддерживается грантом NIH P30GM127607 и грантом Американской ассоциации сердца 16SDG29950012. RB поддерживается P01HL78825 и UM1HL113530.

Все процедуры для животных были в соответствии с институциональными руководящими принципами Университета Луисвилла и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию.
1. Подготовка к нарезке (за день до нарезки)
<ol><li>Подготовка вибрирующ?...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Здесь мы описываем подробный видеопротокол для нашего недавно опубликованного метода для упрощенной средней пропускной способностью (процессы до 48 ломтиков / устройства) метод, который позволяет культуры свиного сердца ломтики в течение периода достаточно долго, чтобы проверить остр...

Препарат индуцированной кардиотоксичности является основной причиной вывода рынка1. В последнее десятилетие20-го века, восемь не сердечно-сосудистых препаратов были сняты с рынка, поскольку они привели к внезапной смерти из-за желудочковой аритмии2. Кроме того, несколько противораковых методов лечения (в то время как во многих случаях эффективным) может привести к нескольким кардиотоксическим эффектам, включая кардиомиопатию и аритмии. Например, как традиционные (например, антрациклы и радиация), так и целевая (например, трастузумаб) терапия рака молочной железы могут привести к сердечно-сосудистым осложнениям у подмножества пациентов3. Тесное сотрудничество между кардиологами и онкологами (через формирующуюся область "кардиоонкологии") помогло сделать эти осложнения управляемыми, гарантируя, что пациенты могут быть эффективно лечить2. Менее ясны сердечно-сосудистые эффекты новых агентов, в том числе Her2 и PI3K ингибиторы, особенно когда терапии используются в комбинации. Таким образом, существует растущая потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга сердечно-сосудистой токсичности, связанной с возникающими противораковыми методами лечения до клинических испытаний на людях. Отсутствие культурных систем для тканей сердца человека, которые функционально и структурно жизнеспособны для более чем 24 ч является ограничивающим фактором для надежного тестирования кардиотоксичности. Поэтому необходимо срочно разработать надежную систему культивирования тканей сердца человека в физиологических условиях для тестирования токсичности лекарств.
Недавнее движение в направлении использования антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) в кардиотоксичности тестирования предоставил частичное решение для решения этой проблемы; однако, незрелый характер hiPSC-CMs и потеря целостности ткани по сравнению с многоклеточной природой сердечной ткани являются основными ограничениями этой технологии4. Недавнее исследование частично преодолело это ограничение путем изготовления сердечных тканей из HIPSC-CMs на гидрогелях и подвергая их постепенному увеличению электрической стимуляции с течением времени5. Однако их электромеханические свойства не достигли зрелости, наблюдаемой у взрослого человека миокарда. Кроме того, сердечная ткань структурно сложнее, состоящая из различных типов клеток, включая эндотелиальные клетки, нейроны и различные типы стромальных фибробластов, связанных вместе с очень специфической смесью внеклеточных матричных белков6. Эта неоднородность некардиомиоцитной популяции клеток7,,8,,9 у сердца взрослых млекопитающих является основным препятствием в моделировании сердечной ткани с использованием отдельных типов клеток. Эти основные ограничения подчеркивают важность разработки методов, позволяющих культуре нетронутой сердечной ткани для оптимальных исследований с участием физиологических и патологических состояний сердца5.
Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутой человеческой миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной 3D многоклеточной системе, которая похожа на ткани сердца человека, которые могут надежно отражать физиологические или патологические условия миокарда человека. Тем не менее, его использование было серьезно ограничено коротким периодом жизнеспособности в культуре, который не выходит за пределы 24 ч с использованием самых надежных протоколов сообщили до 201810,11,12. Это ограничение было связано с несколькими факторами, включая использование воздушно-жидкого интерфейса для культуры ломтики, и использование простой среды культуры, которая не поддерживает высокие энергетические требования сердечной ткани. Недавно мы разработали систему подводной культуры, которая способна обеспечить непрерывную электрическую стимуляцию и оптимизировать компоненты культуры средств массовой информации, чтобы сохранить срезы сердечной ткани жизнеспособными на срок до 6 дней13. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, чтобы закрыть разрыв между доклиническими и клиническими результатами тестирования. В текущей статье мы подробно описываем протокол для нарезки и культивирования ломтиков сердца с помощью свиного сердца в качестве примера. Тот же процесс применяется к человеческому, собаке, овце или кошке сердца. С помощью этого протокола мы надеемся распространить технологию в другие лаборатории научного сообщества.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Многие новые препараты не в клинических исследованиях из-за кардиотоксических побочных эффектов, как в настоящее время доступны в пробирке анализы и in vivo животных моделей плохо предсказать человека сердечной обязательств, что создает многомиллиардное бремя на фармацевтической промышленности. Таким образом, во всем мире существует неудовлетворенная медицинская потребность в более эффективных подходах к выявлению сердечно-токсичности наркотиков, прежде чем проводить дорогостоящие и трудоемкие испытания «первых в людях». В настоящее время, только незрелые сердечные клетки (человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) используются для проверки терапевтической эффективности и токсичности наркотиков, поскольку они являются единственными человеческими сердечными клетками, которые могут быть культивированы в течение длительных периодов времени для проверки эффективности и токсичности препарата. Однако один тип клеток не может воспроизвести фенотип сложной 3D-ткани сердца, которая формируется из нескольких типов клеток. Важно отметить, что влияние препаратов необходимо протестировать на взрослых кардиомиоцитов, которые имеют различные характеристики и токсичность реакции по сравнению с незрелыми hiPSC-CMs. Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутыми человеческого миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной многоклеточной системе, которая имитирует ткани сердца человека и отражает физиологические или патологические условия миокарда человека. Недавно, путем оптимизации компонентов культурных медиа и условий культуры, чтобы включить непрерывную электрическую стимуляцию на уровне 1,2 Гц и прерывистую оксигенацию культуры среды, мы разработали новую систему культуры, которая сохраняет жизнеспособность и функциональность человеческих и свиных ломтиков сердца в течение 6 дней в культуре. В текущем протоколе мы подробно описываем метод нарезки и культивирования свиного сердца в качестве примера. Тот же протокол используется для культуры ломтики из человеческих, собак, овец или кошек сердца. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, которая закрывает разрыв между результатами доклинических и клинических испытаний.

Используя коммерчески доступные клеточной культуры электрического стимулятора, который может вместить восемь 6 хорошо пластин ы сразу, мы эмулировали взрослых сердечных среды, вызывая электрическую стимуляцию на физиологической частоте (1,2 Гц), и скрининг для основн?...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Этот протокол описывает, как нарезать и культуры сердечной ткани в физиологических условиях в течение 6 дней. Эта культурная система может быть использована в качестве платформы для тестирования эффективности новых терапевтических препаратов сердечной недостаточности, а также надежного тестирования острой кардиотоксичности в 3D-модели сердца.

Нарезка и культивирование свиных сердец в физиологических условиях

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Этот протокол для нарезки и культивирования секций сердечной ткани в течение шести дней в физиологических условиях, которые могут быть использованы для острого тестирования сердечной токсичности, а также тестирования эффективности терапии сердечной недостаточности. Эта культурная система может стать мощной прогностический человек на месте модели для острого сердечного тестирования токсичности, что закрывает разрыв между доклинических и клинических результатов тестирования. Демонстрацией процедур будет Цинхуэй Цюй, руководитель лаборатории из нашей лаборатории.Чтобы получить кусочки свиной ткани сердца, сначала добавьте лед в тканевую ванну охлаждающую куртку виброма и добавьте в ванну раствор Тирода. Используйте одну литровую пластиковую банку для сбора расплавленного стока льда из охлаждающей куртки ванны ткани и перенесите свиное сердце в лоток, содержащий один литр свежего холодного кардиоплегического раствора в шкафу биобезопасности. Используйте втягиваемые стерильные скальпели, чтобы вскрыть сердце, чтобы изолировать левый желудочек и использовать прямоугольные лезвия бритвы, чтобы разрезать левый желудочек на один-два кубических сантиметра блоков.Отложите один блок ткани для нарезки и поместите оставшиеся кусочки блока ткани в 50 миллилитровую трубку холодного раствора тирода на льду. Аккуратно массируйте зарезервированный блок ткани и добавьте одну-две капли ткани клея к держателю металлического образца вибромы. Придерживайтесь кусок 4%agar блок с площадью поверхности около одного квадратного сантиметра к клею и добавить от одной до двух капель ткани клея к агару.Прикрепите блок сердца к стороне агара сердечного эпикардия вниз с тканью, как плоский против держателя, как это возможно, и место держателя ткани с блоком сердца в нарезке ванны вибромы. Очень важно, чтобы придерживаться блока сердца к агару с сердечной стороны эпикардия лицом вниз на ткани клея и убедиться, что ткань как можно более плоским. Затем прикрепите кислородную трубку к нарезной ванне и металлическому подносу, наполненному раствором Tyrode, и поместите 40 микрометровых клеточных ситечко на металлический лоток для сбора секций сердечной ткани по мере их нарезки.Используйте программное обеспечение для работы с вибромой, чтобы регулировать высоту лезвия и образца так, чтобы лезвие было близко к верхней части ткани, но ниже папиллярных мышц и жидкости покрывало ткань и лезвие. Выберите заранее, чтобы настроить, где начать нарезки ткани. Нажмите ломтик, чтобы увеличить скорость и использовать ручку, чтобы переместить лезвие к краю ткани.Нажмите ломтик снова, чтобы остановить и заранее, чтобы инактивировать процесс. Затем отрегулируйте параметры резки, как указано, и нажмите ломтик, чтобы начать нарезку ткани. Когда лезвие достигает конца ткани, но прежде чем он попадает в конец держателя образца, нажмите ломтик снова, чтобы остановить и нажмите вернуться, чтобы вернуться в положение старта.Когда ломтики достигают полной длины и, как представляется, хорошего качества, используйте пластиковые пастер пипетки заполнены холодным раствором тирод мягко собирать ткани из ванны с помощью миппов и пружинных ножниц, чтобы вывихнуть ломтик из сердца по мере необходимости. Поместите каждый собранный кусочек в одноклеточный ситечко в оксигенированную ванну Tyrode и используйте раствор в пипетку, чтобы нажать ткань на поверхность ситечко клетки. Затем поместите металлическую шайбу на верхнюю часть ткани, чтобы удержать ее.После по крайней мере один час в кислородом Tyrode раствор, обрезать за пределами каждого ломтика, чтобы удалить любые неравномерные края и клей конце каждого ломтика на шесть миллиметров широкий кусок стерилизованного полиуретана принтера сроки пояса со встроенными металлическими проводами. Поместите поддерживаемые ломтики сердца в шесть хорошо пластин, содержащих шесть миллилитров культуры среды на колодец и использовать стерильные типсы, чтобы убедиться, что ткань находится в центре хорошо. Позаботьтесь о том, чтобы крышка пластины не касалась ткани и не поместит пластину на культурную пластину так, чтобы изогнутая сторона крышки пластины совпадает с угловой стороной пластины и чтобы квадратные углы выстраивались.Поместите ломтики в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор. Замените супернатанты культуры шестью миллилитров свежей кислородной культуры среды три раза в день. Подключите крышку к электрическому стимулятору культуры клетки и отрегулируйте стимулятор для того чтобы непрерывно поставить 10 вольт электричества и частоту hertz 1.2 к ломтикам сердца.После подключения к стимуляции, ломтики сердца начнут биться. Каждый день в течение полудня изменения средств массовой информации, заменить стимуляции пластины крышку из культуры блюдо, чтобы предотвратить выброс токсичных частиц графита в среде культуры. Вставьте белую вилку пены, где используемая крышка подключается к кабелю для электрического стимулятора культуры клеток, чтобы предотвратить повреждение воды электрической цепи и поместить крышку пластины в ванну с автоматической водой, дополненной 2X антибиотиком/антимикотикой.На следующий день, обеззараживать крышку пластины в 70% этанола ванну в течение пяти до 15 минут, прежде чем передать крышку в свежей автоклавированной водяной бане, дополненной 2X антибиотик / антимикотик в течение трех минут. После полоскания крышки пластины, используйте этанол распыляется чистой ворсинки без салфетки, чтобы удалить остатки воды из пластиковых частей и удалить белую вилку пены. Затем крышка готова к размещению обратно в культурную тарелку.Используя эту новую биомиметическую установку культуры, как попродемонстрировано, свиные ломтики сердца жизнеспособность была сохранена в течение шести дней, как оценивается MTT анализа. В первые шесть дней, подобно ответам, наблюдаемым для свежих ломтиков сердца, в кардиомиоцитах свиного сердца нет спонтанных преходящих кальция. Кардиомиоциты действительно реагировали на внешнюю электрическую и бета-адренергическую стимуляцию.Кроме того, контрактильной силы и ответы на изопротеренол были сохранены в сердце ломтик культуры на срок до шести дней, аналогичные тем, которые наблюдаются в свежих ломтиков сердца. Несколько структурных и функциональных оценок могут быть выполнены на срезах сердца, включая анализ жизнеспособности МТТ, иммуностимулятор, электронную микроскопию, переходные измерения кальция, оценки контрактильной функции, метаболические оценки и анализ. В настоящее время мы используем эту культурную систему для проверки острой сердечной токсичности и эффективности препаратов и генной терапии, представляющих интерес для свиней и человеческих ломтиков сердца.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Оценка функции сердца и энергетика в изолированном сердце мыши, используя 31 P ЯМР-спектроскопии

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH флуоресценции изолированных бивентрикулярной рабочей Кролик сердца

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Снижение стресса левых стенок левого желудочка и улучшение функции сердца в случае невозможности использования Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Интрамиокардиальной сотовый поставки: Наблюдения в мышиных сердцах

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Подробный протокол для физиологических параметров сбора и анализа данных в критических нейрохирургических больных

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Кохлеарная имплантация в морской свинки

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Минимально инвазивные модели для анализа Endochondral перелом, исцеление в мышей стандартных биомеханических условиях

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Функциональные и физиологические методы оценки медианной регенерации нервов у крысы

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Оптокардиография и электрофизиология Исследования Ex Vivo Langendorff-перфизиозных сердец

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...