Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM stöds av NIH-bidraget P30GM127607 och American Heart Association grant 16SDG29950012. RB stöds av P01HL78825 och UM1HL113530.

Alla djurförsök var i enlighet med de institutionella riktlinjerna från University of Louisville och godkändes av institutionella djurvårds- och användningskommittén.
1. Förberedelse för skivning (en dag före skivning)
<ol><li>Beredning av den vibrerande mikrotomen
	<ol>
<li>Placera keramiska bladet i hållaren genom att följa dessa steg: Placera den vassa kanten först i bladverktygets spår. Sätt sedan in bladet i hållaren genom att lossa de två skruvarna på...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Här beskriver vi detaljerade videoprotokoll för vår nyligen publicerade metod för förenklad medium genomströmning (processer upp till 48 skivor / enhet) metod som möjliggör kultur av svin hjärta skivor under en period tillräckligt lång för att testa akut kardiotoxicitet13. De föreslagna förhållandena efterliknar miljön i hjärtat, inklusive frekvensen av elektrisk stimulering, näringstillgänglighet, och intermittent syresättning. Vi tillskriver den långvariga livskraften hos hj...

Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är en viktig orsak till återtag på marknaden1. Under det sista årtiondet av20-talet, åtta icke-kardiovaskulära läkemedel drogs tillbaka från marknaden eftersom de resulterade i plötslig död på grund av ventrikulära arytmier2. Dessutom, flera anti-cancer terapier (medan i många fall effektiva) kan leda till flera kardiotoxiska effekter inklusive kardiomyopati och arytmier. Till exempel kan både traditionella (t.ex. antracykliner och strålning) och riktade (t.ex. trastuzumab) bröstcancerbehandlingar resultera i kardiovaskulära komplikationer hos en delmängd av patienter3. Ett nära samarbete mellan kardiologer och onkologer (via det framväxande området "kardio-onkologi") har bidragit till att göra dessa komplikationer hanterbara att säkerställa att patienter kan behandlas effektivt2. Mindre tydliga är de kardiovaskulära effekterna av nyare medel, inklusive Her2- och PI3K-hämmare, särskilt när terapier används i kombination. Därför finns det ett växande behov av tillförlitliga prekliniska screening strategier för kardiovaskulär toxicitet i samband med nya anti-cancer terapier före kliniska prövningar på människa. Bristen på tillgång till kultursystem för mänskliga hjärtvävnad som är funktionellt och strukturellt livskraftig för mer än 24 h är en begränsande faktor för tillförlitlig konditionsränxicitet testning. Därför finns det ett akut behov av att utveckla ett tillförlitligt system för odling av mänsklig hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden för att testa läkemedelstoxicitet.
Den senaste tidens steg mot användning av humaninducerade pluripotenta stamceller kardiomyocyter (hiPSC-CMs) i kardiotoxicitet testning har gett en partiell lösning för att ta itu med detta problem; Dock är den omogna karaktären hos hiPSC-CMs och förlusten av vävnadsintegritet jämfört med den flercelliga karaktären hos hjärtvävnaden stora begränsningar av denna teknik4. En nyligen genomförd studie har delvis övervinna denna begränsning genom tillverkning av hjärtvävnader från hiPSC-CMs på hydrogeler och utsätta dem för gradvis ökning av elektrisk stimulering över tiden5. Deras elektromekaniska egenskaper uppnådde dock inte mognaden som sågs i det vuxna mänskliga hjärtmuskeln. Dessutom är hjärtvävnaden strukturellt mer komplicerad, som består av olika celltyper inklusive endotelceller, nervceller och olika typer av stromala fibroblaster kopplade tillsammans med en mycket specifik blandning av extracellulära matrisproteiner6. Denna heterogenitet av icke-kardiomyocytecellpopulationen 7,8,9 i den vuxna däggdjur hjärta är ett stort hinder i modellering hjärtvävnad med hjälp av enskilda celltyper. Dessa stora begränsningar belyser vikten av att utveckla metoder för att möjliggöra odling av intakt hjärtvävnad för optimala studier med fysiologiska och patologiska tillstånd i hjärtat5.
Odling av mänskliga hjärtskivor är en lovande modell av intakt mänskligt hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett 3D flercellssystem som liknar den mänskliga hjärtvävnaden som på ett tillförlitligt sätt kan återspegla de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Dess användning har dock varit kraftigt begränsad av den korta perioden av livskraft i kulturen, som inte sträcker sig längre än 24 timmar med hjälp av de mest robusta protokoll som rapporterats fram till 201810,11,12. Denna begränsning berodde på flera faktorer, inklusive användning av luft-flytande gränssnitt för att odla skivorna, och användningen av en enkel odling medium som inte stöder de höga energiska kraven i hjärtvävnaden. Vi har nyligen utvecklat ett nedsänkt kultursystem som kan ge kontinuerlig elektrisk stimulering och optimerat komponenterna kulturmedia för att hålla hjärtvävnadsskivorna livskraftiga i upp till 6 dagar13. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning för att minska klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat. I den aktuella artikeln beskriver vi protokollet för skivning och odling av hjärtat skivor med hjälp av en gris hjärta som ett exempel. Samma process tillämpas på människor, hund, får eller katt hjärtan. Med detta protokoll hoppas vi kunna sprida tekniken till andra laboratorier i forskarvärlden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Många nya läkemedel misslyckas i kliniska studier på grund av kardiotoxiska biverkningar som den för närvarande tillgängliga in vitro-analyser och in vivo djurmodeller dåligt förutsäga mänskliga hjärtåtaganden, utgör en flera miljarder dollar börda på läkemedelsindustrin. Därför finns det ett världsomspännande otillfredsställt medicinskt behov av bättre metoder för att identifiera narkotika kardiotoxicitet innan företaget kostsamma och tidskrävande "första i människan" prövningar. För närvarande används endast omogna hjärtceller (humaninducerad pluripotenta stamceller kardiomyocyter [hiPSC-CMs]) för att testa terapeutisk effektivitet och läkemedelstoxicitet eftersom de är de enda mänskliga hjärtceller som kan odlas under längre perioder läkemedelseffekt och toxicitet. En enda celltyp kan dock inte replikera fenotypen av den komplexa 3D-hjärtvävnaden som bildas av flera celltyper. Viktigt, effekten av läkemedel måste testas på vuxna kardiomyocyter, som har olika egenskaper och toxicitet svar jämfört med omogna hiPSC-CMs. Culturing mänskliga hjärtat skivor är en lovande modell av intakt mänskliga hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett flercelligt system som efterliknar den mänskliga hjärtvävnaden och återspeglar de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Nyligen, genom optimering av kulturmediekomponenter och kulturförhållanden för att inkludera kontinuerlig elektrisk stimulering vid 1,2 Hz och intermittent syresättning av odlingsmediet, utvecklade vi en ny kultur system setup som bevarar lönsamheten och funktionalitet av mänskliga och gris hjärta skivor för 6 dagar i kultur. I det nuvarande protokollet beskriver vi metoden för skivning och odling av grishjärta som ett exempel. Samma protokoll används för att odla skivor från människor, hund, får eller katt hjärtan. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning som stänger klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat.

Med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cellkultur elektrisk stimulator som rymmer åtta 6 brunnsplattor på en gång, emulerade vi den vuxna hjärtmiljön genom att inducera elektrisk stimulering vid den fysiologiska frekvensen (1,2 Hz), och screenas för de grundläggande medelstora komponenterna för att förlänga varaktigheten av funktionella grishjärta skivor i kultur13. Eftersom gris och mänskliga hjärtan är liknande i storlek och anatomi<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Detta protokoll beskriver hur man skär och kultur hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden i 6 dagar. Detta kultursystem skulle kunna användas som en plattform för att testa effekten av nya hjärtsvikt therapeutics samt tillförlitlig testning av akut kardiotoxicitet i en 3D-hjärtmodell.

Skivning och odling Gris hjärtan under fysiologiska förhållanden

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Detta protokoll är för skivning och odling av hjärtvävnad sektioner för sex dagar under fysiologiska förhållanden som kan användas för akut hjärt toxicitet testning samt testa effekten av hjärtsvikt terapier. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv human in situ-modell för akut hjärttoxicitetstestning som stänger gapet mellan prekliniska och kliniska testresultat. Demonstrera förfarandena kommer att Qinghui Qu, en lab chef från vårt laboratorium.För att erhålla skivor gris hjärta vävnad, först lägga is till vävnad bad kylning jacka av en vibratom och lägga Tyrode lösning till badet. Använd en en liter plast burk för att samla den smälta is avrinning från vävnad bad kylning jacka och överföra grisen hjärtat till en bricka som innehåller en liter färsk kall cardioplegic lösning i en biosäkerhet skåp. Använd infällbara sterila skalpell för att dissekera hjärtat för att isolera den vänstra ventrikeln och använd rektangulära rakblad för att skära den vänstra ventrikeln i ett till två kubcentimeterblock.Ställ undan ett vävnadsblock för skivning och placera de återstående vävnadsblockbitarna i ett 50 milliliter rör kall tyrodelösning på is. Massera försiktigt den reserverade vävnadsblocket och tillsätt en till två droppar vävnadslim till metallprovhållaren av vibratomen. Stick en bit av 4%agar block med en yta på ungefär en kvadratcentimeter till limmet och tillsätt en till två droppar vävnad lim till agar.Fäst hjärtblocket på agar-epikariumsidan nedåt med vävnaden så platt mot hållaren som möjligt och placera vävnadshållaren med hjärtblocket i vibratomens skivningsbad. Det är viktigt att hålla hjärtblocket till agar med hjärt epicardium sidan vänd nedåt på vävnaden lim och se till att vävnaden är så platt som möjligt. Fäst sedan syreröret på skivningsbadet och metallbrickan fylld med Tyrode-lösning och placera 40 mikrometercellsiler på metallbrickan för att samla ihop hjärtvävnadssektionerna när de är skivade.Använd vibratome-bruksprogrammet för att justera höjden på bladet och provet så att bladet är nära toppen av vävnaden men under papillära muskler och vätska täcker vävnaden och bladet. Välj förskott för att justera var du ska börja skära vävnaden. Tryck slice för att öka hastigheten och använd vredet för att flytta bladet mot kanten av vävnaden.Tryck på skiva igen för att stoppa och avancera för att inaktivera processen. Justera sedan skärparametrarna som indikerat och tryck slice för att börja skära vävnaden. När bladet når änden av vävnaden men innan det träffar änden av preparathållaren, tryck slice igen för att stoppa och tryck tillbaka för att gå tillbaka till startpositionen.När skivorna når full längd och verkar vara av god kvalitet, använd en plast Pasteur pipetten fylld med kall Tyrode lösning för att försiktigt samla in vävnaden från badet med hjälp av tlysen och vårsax för att rubba skiva från hjärtat vid behov. Placera varje uppsamlad skiva i en enda cellsil i det syresatta Tyrodebadet och använd lösningen i pipetten för att trycka på vävnaden på cellsilytan. Placera sedan en metallbricka på toppen av vävnaden för att hålla den nere.Efter minst en timme i syresatt Tyrode lösning, trimma utsidan av varje skiva för att ta bort eventuella ojämna kanter och limma änden av varje skiva på en sex millimeter bred bit steriliserad polyuretan skrivare kuggrem med inbäddade metalltrådar. Placera de stödda hjärtskivorna i sex-brunnsplattor som innehåller sex milliliter odlingsmedium per brunn och använd sterila trikåer för att se till att vävnaden är i mitten av brunnen. Var försiktig så att plattans hölje inte kommer att vidröra vävnaden och placera plattan på odlingsplattan så att den böjda sidan av plattans hölje stämmer överens med plattans vinklade sida och att de fyrkantiga hörnen stämmer upp.Placera skivorna i en 37 grader Celsius och 5% koldioxid inkubator. Byt ut kultursupnatanterna mot sex milliliter färskt syresatt odlingsmedium tre gånger per dag. Anslut locket till cellkulturen elektriska stimulator och justera stimulatorn att kontinuerligt leverera 10 volt el och en 1,2 hertz frekvens till hjärtat skivor.Efter att ha kopplat in stimuleringen kommer hjärtskivorna att börja slå. Vardagen under middagsmediabytet, byt ut stimuleringsplattans omslag från odlingsskålen för att förhindra utsläpp av giftiga grafitpartiklar i odlingsmediet. Sätt i den vita skumpluggen där det använda överdraget ansluts till kabeln för cellkulturens elektriska stimulator för att förhindra vattenskador på den elektriska kretsen och placera plåtkåpan i ett bad av autoklaverat vatten kompletterat med 2X antibiotikum/antimykotisk.Nästa dag, sanera plattan locket i en 70%etanol bad i fem till 15 minuter innan du överför locket till en färsk autoklaverat vattenbad kompletteras med 2X antibiotika / antimycotic i tre minuter. När du har sköljt plåtkåpan använder du en etanolsprutad ren luddfri torka för att avlägsna eventuellt restvatten från plastdelarna och ta bort den vita skumpluggen. Omslaget är sedan klart att placeras tillbaka in i odlingsplattan.Med hjälp av denna nya biomimetiska kultur setup som visat, gris hjärta skivor livskraft bibehölls i sex dagar som bedöms av MTT analys. Under de första sex dagarna, liknande de svar som observerats för färskt hjärta skivor, det finns inga spontana kalcium transienter inom grisen hjärtat skiva kardiomyocyter. Kardiomyocyter svarade på externa elektriska och beta-adrenerga stimulering.Dessutom var den kontraktila kraft och svar på isoproterenol upprätthålls i hjärtat skiva kultur i upp till sex dagar liknande den som observerats i färskt hjärta skivor. Flera strukturella och funktionella bedömningar kan utföras på hjärtat skivor inklusive MTT lönsamhet analyser, immunfärgning, elektronmikroskopi, kalcium transienta mätningar, kontraktil funktion bedömningar, metaboliska bedömningar och analys. Vi använder för närvarande detta kultursystem för att testa akut hjärttoxicitet och effekt av läkemedel och genterapier av intresse för gris- och människohjärtaskivor.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bedömning av hjärtfunktionen och Energetics i isolerade Mus Hearts Använda 31 P NMR-spektroskopi

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH Fluorescens avbildning av isolerade biventrikulär Arbeta kaninhjärtan

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Minskning av vänster kammares Wall Stress och renovering i funktion i avsaknad Hearts använder Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardial Cell Leverans: Observationer i Murina Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Ett detaljerat protokoll för fysiologiska parametrar förvärv och analys i Neurokirurgiska kritiska patienter

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Cochlear Implantation i marsvin

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

En minimalinvasiv modell för att analysera Endochondral Fracture Healing hos möss Under standardiserade biomekaniska förhållanden

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Funktionella och fysiologiska metoder för att utvärdera mediannervregenerering hos råtta

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...