Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM NIH hibe P30GM127607 ve Amerikan Kalp Derneği hibe 16SDG29950012 tarafından desteklenir. RB P01HL78825 ve UM1HL113530 tarafından desteklenir.

Tüm hayvan prosedürleri Louisville Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Dilimleme için hazırlık (Dilimlemeden Bir Gün Önce)
<ol><li>Titreşimli mikrotomun hazırlanması
	<ol>
<li>Seramik bıçağı şu adımları izleyerek tutucuya yerleştirin: bıçağı dikkatlice açtıktan sonra keskin kenarı önce bıçak aletinin yuvasına yerleştirin. Daha sonra, tutucunun kol...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Burada basitleştirilmiş orta iş batışı (48 dilim/cihaza kadar süreçler) akut kardiyotoksisiteyi test etmek için yeterince uzun bir süre domuz kalp dilimleri kültürünü sağlayan yöntem için son zamanlarda yayınlanan yöntemimiz için ayrıntılı video protokolünü açıklıyoruz13. Önerilen koşullar, elektriksel stimülasyon sıklığı, besin kullanılabilirliği ve aralıklı oksijenasyon da dahil olmak üzere kalbin çevresini taklit eder. Biyomimetik uyarılmış kültürü...

İlaca bağlı kardiyotoksisite piyasa çekilmesi önemli bir nedenidir1. 20. yüzyılın son on yılında, sekiz non-kardiyovasküler ilaçlar piyasadan çekildi onlar ventriküler aritmiler nedeniyle ani ölümle sonuçlandı2. Buna ek olarak, çeşitli anti-kanser tedavileri (birçok durumda etkili iken) kardiyomiyopati ve aritmiler de dahil olmak üzere çeşitli kardiyotoksik etkilere yol açabilir. Örneğin, hem geleneksel (örneğin, antrasiklinler ve radyasyon) ve hedeflenen (örneğin, trastuzumab) meme kanseri tedavileri hastaların bir alt kümesinde kardiyovasküler komplikasyonlara neden olabilir3. Kardiyologlar ve onkologlar arasında yakın bir işbirliği ("kardiyo-onkoloji" gelişmekte olan alan üzerinden) hastaların etkili bir şekilde tedavi edilebilir sağlanması bu komplikasyonları yönetilebilir hale yardımcı oldu2. Her2 ve PI3K inhibitörleri de dahil olmak üzere yeni ajanların kardiyovasküler etkileri daha az belirgindir, özellikle tedaviler birlikte kullanıldığında. Bu nedenle, insan klinik çalışmalar öncesinde ortaya çıkan anti-kanser tedavileri ile ilişkili kardiyovasküler toksisite için güvenilir preklinik tarama stratejileri için artan bir ihtiyaç vardır. 24 saatten fazla işlevsel ve yapısal olarak uygulanabilir olan insan kalp dokusu için kültür sistemlerinin bulunmaması güvenilir kardiyotoksisite testi için sınırlayıcı bir faktördür. Bu nedenle, ilaç toksisitesi test etmek için fizyolojik koşullar altında insan kalp dokusu kültüriçin güvenilir bir sistem geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Kardiyotoksisite testlerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPSC-CMs) kullanımına yönelik son hamle, bu sorunu çözmek için kısmi bir çözüm sağlamıştır; ancak, hiPSC-CMs olgunlaşmamış doğası ve kalp dokusunun çok hücreli doğası ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün kaybı bu teknolojinin önemli sınırlamalar vardır4. Yakın tarihli bir çalışma kısmen hidrojeller üzerinde hiPSC-CMs kardiyak dokuların imalatı ve zaman içinde elektriksel stimülasyon kademeli artışa tabi ile bu sınırlama üstesinden gelmiştir5. Ancak, elektromekanik özellikleri yetişkin insan miyokardinde görülen olgunluğa ulaşamadı. Ayrıca, kalp dokusu yapısal olarak daha karmaşıktır, endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri oluşan, nöronlar ve stromal fibroblastlar çeşitli türleri ile birlikte hücre dışı matriks proteinlerinin çok özel bir karışımı ile bağlantılı6. Erişkin memeli kalpte kardiyomiyosit hücre popülasyonu7,8,9 bu heterojenlik tek tek hücre tipleri kullanılarak kalp dokusumodellemesinde önemli bir engeldir. Bu önemli sınırlamalar kalbin fizyolojik ve patolojik koşullarını içeren optimal çalışmalar için bozulmamış kardiyak doku kültürünü sağlamak için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamak5.
Culturing insan kalp dilimleri bozulmamış insan miyokardiyum umut verici bir modeldir. Bu teknoloji, insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını güvenilir bir şekilde yansıtabilecek insan kalp dokusuna benzeyen tam bir 3Boyutlu çok hücreli sisteme erişim sağlar. Ancak, kullanımı ciddi 2018 10,11,,12kadar bildirilen en sağlam protokolleri kullanarak 24 saat ötesine geçmez kültür, canlılık kısa süre ile sınırlı olmuştur.12 Bu sınırlama, dilimleri kültüre getirmek için hava-sıvı arabiriminin kullanımı ve kardiyak dokunun yüksek enerjik taleplerini desteklemeyen basit bir kültür ortamının kullanımı da dahil olmak üzere birden fazla faktörden kaynaklandı. Biz son zamanlarda sürekli elektrik stimülasyon sağlamak mümkün ve kadar 6 gün13için kardiyak doku dilimleri canlı tutmak için kültür medya bileşenleri optimize bir batık kültür sistemi geliştirdik. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatmak için akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Mevcut makalede, bir örnek olarak bir domuz kalbi kullanarak kalp dilimleri dilimleme ve kültüriçin protokol ayrıntılı vardır. Aynı işlem insan, köpek, koyun veya kedi kalpleri için de uygulanır. Bu protokolle, teknolojiyi bilim camiasındaki diğer laboratuvarlara yaymayı umuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Birçok yeni ilaçlar şu anda mevcut in vitro tahliller ve in vivo hayvan modelleri kötü insan kardiyak yükümlülüklerini tahmin olarak kardiyotoksik yan etkileri nedeniyle klinik çalışmalarda başarısız, ilaç endüstrisi üzerinde multi-milyar dolarlık bir yük poz. Bu nedenle, pahalı ve zaman alıcı 'insan ilk' denemeler üstlenmeden önce ilaç kardiyotoksisite belirlemek için daha iyi yaklaşımlar için dünya çapında karşılanmamış tıbbi ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece olgunlaşmamış kalp hücreleri (insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler [hiPSC-CMs]) onlar uzun süre kültürlenebilir tek insan kalp hücreleri olarak terapötik verimlilik ve ilaç toksisitesi test etmek için kullanılır uyuşturucu etkinliğini ve toksisitesini test etmek için gereklidir. Ancak, tek bir hücre tipi birden fazla hücre tipi oluşan karmaşık 3D kalp dokusunun fenotip kopyalayamaz. Daha da önemlisi, ilaçların etkisi yetişkin kardiyomiyositler üzerinde test edilmesi gerekir, hangi farklı özellikleri ve toksisite yanıtları olgunlaşmamış hiPSC-CMs ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, insan kalp dokusunu taklit eden ve insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını yansıtan tam bir çok hücreli sisteme erişim sağlar. Son zamanlarda, kültür medya bileşenlerinin optimizasyonu ve kültür koşulları nın 1.2 Hz'de sürekli elektriksel uyarımı ve kültür ortamının aralıklı oksijenletılmasını içermesi ile, yaşanabilirliği koruyan yeni bir kültür sistemi kurulumu geliştirdik. ve kültürde 6 gün boyunca insan ve domuz kalp dilimleri işlevselliği. Mevcut protokolde, domuz kalbini dilimleme ve dilimleme yöntemini örnek olarak ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Aynı protokol insan, köpek, koyun veya kedi kalplerinden gelen kültür dilimleri için kullanılır. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatır akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir.

Aynı anda sekiz 6 kuyu plakaları barındırabilir bir ticari hücre kültürü elektrik uyarıcı kullanarak, fizyolojik frekansta elektriksel stimülasyon indükleyerek yetişkin kardiyak ortam taklit (1.2 Hz), ve kültür fonksiyonel domuz kalp dilimleri süresini uzatmak için temel orta bileşenleri için taranmış13. Domuz ve insan kalpleri boyutu ve anatomi15benzer olduğundan, biz domuz kalpleri kullanarak bir biyomimetik kalp dili...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Bu protokol, 6 gün boyunca fizyolojik koşullar altında kalp dokusunun nasıl dilimlenir ve kültürlenir. Bu kültür sistemi yeni kalp yetmezliği terapötik etkinliğini test etmek için bir platform olarak yanı sıra bir 3D kalp modelinde akut kardiyotoksisite güvenilir test olarak kullanılabilir.

Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Bu protokol, akut kardiyak toksisite testi ve kalp yetmezliği tedavilerinin etkinliğini test etmek için kullanılabilecek fizyolojik koşullar altında altı gün boyunca kalp dokusu kesiti ve kültüre alınması içindir. Bu kültür sistemi, klinik öncesi ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatan akut kardiyak toksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Prosedürleri gösteren Qinghui Qu, bizim laboratuvar dan bir laboratuvar yöneticisi olacaktır.Domuz kalp doku dilimleri elde etmek için, ilk bir vibratom doku banyosu soğutma ceket buz ekleyin ve banyo ya Tyrode çözüm ekleyin. Doku banyosu soğutma ceket erimiş buz runoff toplamak ve bir biyogüvenlik kabine taze soğuk kardiyoplejik çözüm bir litre içeren bir tepsiye domuz kalbi aktarmak için bir litre plastik kavanoz kullanın. Sol ventrikül izole etmek için kalp incelemek ve bir ila iki küp santimetre bloklar halinde sol ventrikül kesmek için dikdörtgen jilet kullanmak için geri çekilebilir steril neşter kullanın.Dilimleme için bir doku bloğu kenara koyun ve buz üzerinde soğuk Tyrode çözeltisi 50 mililitrelik tüp içine kalan doku bloğu parçaları yerleştirin. Yavaşça ayrılmış doku bloğu masaj ve vibratom metal örnek tutucu doku tutkal bir ila iki damla ekleyin. Tutkal yaklaşık bir santimetre kare bir yüzey alanı ile% 4 agar blok bir parça sopa ve agar doku tutkal bir ila iki damla ekleyin.Agar kardiyak epikardiyan tarafına kalp bloğunu mümkün olduğunca tutucuya karşı düz olarak doku ile aşağı takın ve kalp bloğu ile doku tutucuyu vibratomun dilimleme banyosuna yerleştirin. Bu doku tutkal aşağı bakan kardiyak epikardi tarafı ile agar için kalp bloğu sopa ve doku mümkün olduğunca düz olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Daha sonra oksijen tüpünü dilimleme banyosuna ve Tyrode çözeltisi ile dolu metal tepsiye takın ve 40 mikrometrelik hücreli süzgeci, dilimlenirken kalp doku bölümlerini toplamak için metal tepsiye yerleştirin.Bıçağın yüksekliğini ayarlamak için vibratom işletim yazılımını kullanın ve bıçağın üst kısmına yakın, ancak papiller kasların ve sıvının altında dokuyu ve bıçağı kaplar. Dokuyu dilimlemeye başlayacağınızı ayarlamak için önceden seçin. Hızı artırmak için dilime basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğümü kullanın.İşlemi durdurmak ve ilerlemek için dilime tekrar basın. Daha sonra belirtilen kesme parametrelerini ayarlayın ve dokuyu dilimleme başlamak için dilime basın. Bıçak dokunun ucuna ulaştığında ancak numune tutucunun ucuna çarpmadan önce, durdurmak için tekrar dilime basın ve başlangıç pozisyonuna geri dönmek için geri dönmek için geri dönün.Dilimler tam uzunluğa ulaştığında ve kaliteli görünüyor, hafifçe forseps ve yay makas kullanarak banyodan doku toplamak için soğuk Tyrode çözeltisi ile dolu plastik bir Pasteur pipet kullanın gerektiği gibi kalpten dilim yerinden çıkarmak için. Toplanan her dilimi oksijenli Tyrode banyosunda tek bir hücresüze yerleştirin ve gazın içinde solüsyonu kullanarak hücre süzgeci yüzeyindeki dokuya basın. Sonra onu tutmak için dokunun üstüne metal bir yıkayıcın yerleştirin.Oksijenli Tyrode çözeltisinde en az bir saat kaldıktan sonra, her dilimin dışını kırparak pürüzlü kenarları çıkarın ve her dilimin ucunu gömülü metal tellerle altı milimetre genişliğindeki sterilleştirilmiş poliüretan yazıcı zamanlama kayışına yapıştırın. Desteklenen kalp dilimlerini kuyu başına altı mililitre kültür ortamı içeren altı kuyulu tabaklara yerleştirin ve dokunun kuyunun merkezinde olduğundan emin olmak için steril çalgılar kullanın. Plaka kapağının dokuya değmemeyenve plakakapağının kavisli tarafının plakanın açılı tarafıyla eşleşip kare köşelerin hizaya girebilen kültür plakasına yerlebir edilebiyi göz önünde bulundurun.Dilimleri 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin. Günde üç kez altı mililitre taze oksijenli kültür ortamı ile kültür supernatants değiştirin. Kapağı hücre kültürü elektrik seladamasına bağlayın ve uyarıcıyı ayarlayarak kalp dilimlerine 10 volt elektrik ve 1,2 hertz frekansı teslim edin.Stimülasyon taktıktan sonra, kalp dilimleri atmaya başlar. Her gün öğle nisbi ortam değişimi sırasında, kültür ortamına toksik grafit parçacıkların salınımını önlemek için kültür çanasından uyarım plakası kapağını değiştirin. Kullanılan kapağın hücre kültürü elektrik uyarıcısının kabloya bağlandığı beyaz köpük fişi takın ve plaka kapağını 2X antibiyotik/antimikotik ile takviye edilmiş otoklavlı su banyosuna yerleştirin.Ertesi gün, üç dakika boyunca 2X antibiyotik / antimycotic ile desteklenen taze bir otoklavlı su banyosu içine kapak aktarmadan önce beş ila 15 dakika boyunca bir 70% etanol banyosu nda plaka kapağı dekontamine. Plaka kapağını duruladıktan sonra, plastik parçalardan kalan suyu çıkarmak ve beyaz köpük fişini çıkarmak için etanol püskürtülen temiz tiftiksiz bir mendil kullanın. Kapak daha sonra kültür plakasına geri yerleştirilmesi için hazırdır.Gösterildiği gibi bu yeni biyomimetik kültür kurulum kullanılarak, domuz kalp dilimleri canlılık MTT tsay tarafından değerlendirildiği gibi altı gün boyunca muhafaza edildi. İlk altı gün içinde, taze kalp dilimleri için gözlenen tepkiler benzer, domuz kalp dilimi kardiyomiyositiçinde hiçbir spontan kalsiyum geçici vardır. Kardiyomiyositler dış elektriksel ve beta-adrenerjik stimülasyona yanıt verdi.Buna ek olarak, kontraktil kuvvet ve izoproterenol yanıtları kadar altı gün taze kalp dilimleri gözlenen benzer kalp dilimi kültüründe muhafaza edildi. MTT canlılık tahlilleri, immünboyama, elektron mikroskobu, kalsiyum geçici ölçümleri, kontraktil fonksiyon değerlendirmeleri, metabolik değerlendirmeler ve analiz dahil olmak üzere kalp dilimleriüzerinde çeşitli yapısal ve fonksiyonel değerlendirmeler yapılabilir. Şu anda akut kardiyak toksisite ve ilaç ve domuz ve insan kalp dilimleri ilgi gen tedavileri etkinliğini test etmek için bu kültür sistemini kullanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Tıp

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

İzole Biventriküler ve NADH Floresans Görüntüleme Tavşan Kalpler Çalışma

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Akut Miyokard İnfarktüsü bir Domuz Modeli İlköğretim Sonuç Değerlendirmesi

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Fizyolojik parametreler için detaylı bir protokol toplama ve analizi Nöroşirürji kritik hastalarda

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Eskiden şiling şimdi domuz koklear implantasyon

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Endochondral standart biyomekanik koşullar altında farelerde şifa kırık çözümlemek için minimal invaziv bir Model

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Sıçanda Median Sinir Rejenerasyonunun Değerlendirilmesinde Fonksiyonel ve Fizyolojik Yöntemler

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...