Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل الوكالة الوطنية لمراقبة التنمية في منطقة سيدا وهرهبات ANRS (J-P. ح) للتجارب وN.B. زمالة (AAP 2017 166). تعترف N.S. بالدعم المقدم من ANRS للحصول على الزمالة (AAP 2016 1)، والمنظمة الأوروبية لبيولوجيا الجزيئية EMBO للزمالة (LT 834 2017)، وبرنامج تمويل الشركات الناشئة "باوشتاين" من كلية الطب في جامعة أولم (LSBN.0147) وDFG دويتشه Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

لا يتم جمع العينات خصيصا لأغراض البحث ولا تعتبر الدراسة الغازية. ومع ذلك، جمع اللوزتين البشرية يتطلب موافقة أخلاقية من قبل السلطات المحلية ذات الصلة. في حالتنا، تمت الموافقة عليها من قبل لجنة حماية الأشخاص (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). وعلاوة على ذلك، يطلب موافقة كل مريض أو ممثل قانوني للحصول على البي...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

اللوزتين البشرية تمثل نموذج فيزيولوجي السابقين فيزيولوجية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية في واجهة المخاطية، لأنها تحاكي دور الجهاز اللمفاوي الثانوي. ومن المثير للاهتمام أن التركيب الخلوي للبلدان عبر التخصصات الإقليمية يشبه مراكز PBMCs ويشمل جميع مجموعات الخلايا الرئيسية، على الرغم ...

وتقتصر الدراسات على الأعضاء البشرية بسبب إمكانية الوصول إلى المعلومات، فضلا عن أسباب أخلاقية واضحة. ومع ذلك ، فهي ضرورية لفهم تعقيد البيولوجيا البشرية بشكل كامل. ثقافات الخلايا المعزولة (الثقافات الأولية أو خطوط الخلايا) هي نظام قياسي في دراسات بيولوجيا الخلايا بسبب توافرها. في حين أن الثقافات الخلية المعزولة سمحت باكتشافات بارزة ، فإن استخدام خطوط الخلايا قد جاء عند التدقيق الدقيق لأنها لا تحاكي تمامًا بيولوجيا الجهاز الحي. ومع ذلك ، فإن ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد أو الأنسجة explants معقدة للغاية4،5،6. في الواقع ، قطعة من الأنسجة أو الجهاز هيطروجينية للغاية لأن تكوينها الخلوي يختلف اعتمادًا على التعريب في الأنسجة. وهكذا، فإن استخدام كتل الأنسجة يتطلب تحليل العديد من النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية، مما يؤدي إلى حاجة عدد كبير من المتبرعين أو المرضى.
الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) مشابهة هيكلياً للغدد الليمفاوية ولكن لها وظائف فريدة من نوعها، لأن دورها الرئيسي هو تنظيم المناعة المخاطية7. على عكس الغدد الليمفاوية، والتي تقع عادة على مسافة ما من الأنسجة، وتقع الشعير عادة مباشرة تحت ظهارة الأنسجة المخاطية. من الناحية النسيجية ، تتكون بشكل رئيسي من تركيزات عالية من الخلايا B و T ، ولكن أيضًا الخلايا التي تقدم المستضد مثل الضامة والخلايا التكجرية. الشعير تشكل حوالي 50٪ من الأنسجة اللمفاوية في جسم الإنسان. وتنقسم الشعير إلى تسع مجموعات اعتمادا على موقعها: غالت (القناة الهضمية- ) ، BALT (bronchus-) ، NALT (الأنف - ) ، CALT (الملتحمة) ، LALT (الحنجرة - ) ، SALT (الجلد - ) ، VALT (vulvo-) ، O -MALT (منظمة) ، ود - مالت (منتشر). و O-MALT يتكون أساسا من اللوزتين من خاتم لوزتيلار والداير وهو الأكثر سهولة MALT8,9. في الواقع، اللوزتين الموجودة في البلعوم تشكل الحاجز الرئيسي لحماية الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي من (المحتملة) الكائنات الحية الدقيقة الغازية10. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية اللوزتين من قبل ظهارة حرشفية غير كيراتينية طبقية ، مدعومة بكبسولة من النسيج الضام تحتوي على الأوعية الدموية والأعصاب واللمفية ، مما يوفر سهولة الوصول إلى الخلايا المناعية11،12. وعلاوة على ذلك، استئصال اللوزتين، وهو الفعل الجراحي لإزالة اللوزتين، هو إجراء شائع يتم إجراؤه على الأطفال الذين يعانون من اضطراب في التنفس، مما يجعل اللوزتين نسيجًا متاحًا بسهولة13 في البيئات الفسيولوجية.
اللوزتين تسمح بدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. في الواقع، في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، لأن اللوزتين تتكون من تركيز عال من الخلايا المناعية، فهي الهدف الرئيسي للتكاثر الفيروسي ولكن أيضا إنتاج كمية كبيرة من السيتوكينات التي لم يتم الكشف عنها في الدورة الدموية14،15. في الولايات ثابتة, نادرة السّكان من فطريّة مثل خلايا حاضرة في مختلفة نسيج مخاطيّ, بما في ذلك اللوزتين, غير أنّ أساسيّا غائبة من دم.
وهكذا، فإن الخلايا أحادية النواة من اللوزتين هي نموذج أكثر أهمية وتعقيداً من الخلايا PBMCs ويمكن أن تجيب على أسئلة أكثر عمقاً. من ناحية أخرى، يمكن استخدام explants الأنسجة تكون معقدة وغير ذات الصلة دائما إلى الدراسات المناعية الفطرية. وهكذا، أنشأنا نموذجا لدراسة تنشيط المناعة المخاطية باستخدام TMCs16. ونصف هنا طريقة لعزل الشركات عبر الأراضي الممَعَرَفَة بشكل فعّال عن اللوزتين البشريتين الطازجتين. هذه الطريقة تسمح باستعادة عدد كبير من الخلايا المناعية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات في الجسم الحي السابق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

دراسة الخلايا المعزولة من الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) يسمح فهم استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية، لأنها يمكن أن نموذج التفاعلات المضيف الممرض في الأنسجة. في حين أن الخلايا المعزولة المستمدة من الأنسجة كانت أول نموذج لثقافة الخلية ، فقد تم إهمال استخدامها لأن الأنسجة قد يكون من الصعب الحصول عليها. في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة وتربية الخلايا أحادية النوى اللوزتين بسهولة (TMCs) من اللوزتين البشرية السليمة لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية. إن عزل اللجان عبر الأراضي المُمَرَكَة من اللوزتين سريع، لأن اللوزتين بالكاد تحتويان على ظهارة وتُسفر عن مليارات من جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية. هذه الطريقة تسمح بالكشف عن إنتاج السيتوكين باستخدام عدة تقنيات، بما في ذلك immunoassays، qPCR، المجهر، تدفق cytometry، الخ. ، على غرار استخدام الخلايا أحادية النوى الطرفية (PBMCs) من الدم. وعلاوة على ذلك، تبدي الشركات عبر الأراضي عبر الوطنية حساسية أكبر لاختبار المخدرات من تلك التي تبديها شركات PBMCs، التي ينبغي النظر فيها من أجل إجراء اختبارات السمية في المستقبل. وهكذا، فإن ثقافات شركات TMCs التي تعمل في الجسم الحي هي نموذج مخاطي سهل وسهل الوصول إليه.

نحن أولاً وصفنا الملامح المناعية للخلايا الموجودة في الثقافة و حللنا كمية TMCs. نحن فينوتاد TMCs من اللوزتين مع عملية استئصال cytometry التدفق. كما هو مبين في الشكل 1، كانت تمثل جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في PBMCs من الدم في TMCs من اللوزتين. بيد أن ت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة بسهولة وتربية الخلايا أحادية النوى tonsillaar من البشر الأصحاء التي تخضع لعملية استئصال اللوزتين الجراحية الجزئية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية.

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

الخلايا أحادية النوى اللوزين هي أكثر أهمية وتعقيدا من خلايا الدم، وعزلها يسمح لدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. تسمح التقنية التي أنشأناها باسترداد عدد كبير من الخلايا المناعية من الأنسجة المخاطية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات الفيفو السابقة. الأسلوب هو واضح جدا، ولكن اللوزتين تحتاج إلى التعامل معها بسرعة وبعناية من أجل تحقيق أقصى قدر من العائد.نقل الأنسجة الطنينية البشرية إلى المختبر كما هو موضح في نص المخطوطة. بعد ذلك، ضع مصفاة الخلية على طبق ثقافة 150 في 25 ملليمتر. ضع جميع أدوات التشريح في طبق آخر لإبقائها معقمة.يجب التعامل مع جميع العينات الرئيسية الخاصة بك بعناية لأنها لم تكن مؤهلة من قبل وقد تحتوي على عوامل معدية. ثم صب برنامج تلفزيوني من القارورة إلى مصفاة، لأنه سوف تحتوي على بعض الخلايا التي قد الخروج اللوزتين. باستخدام ملقط معقمة، نقل اللوزتين من القارورة إلى طبق الثقافة باستخدام ملقط العقيمة.إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني لتزج الشبكة. يستغرق التشريح حوالي 45 دقيقة لكل لوزة. ومن الأهمية بمكان أن تكون لوزات خلال هذا الوقت مغمورة لضمان صلاحية جيدة وغلة الخلية.إزالة الكي الدموية والليفية الأنسجة باستخدام ملقط ومشرط. باستخدام مشرط وملاقط المنحنية، وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة من أقل من نصف سنتيمتر في القطر. قطع جميع الأنسجة بحيث يمكن أن تكون مغمورة قطع صغيرة في جميع الأوقات.ضع بعض قطع الأنسجة في مصفاة الخلية. كشط لهم على الشبكة مع آفة الزجاج حتى طبقة رقيقة جدا من السترما الأبيض يبقى. إزالة والتخلص من stroma لتجنب انسداد الشبكة.ثم استخدام ماصة 10 ملليلتر لنقل تعليق الخلية على الشبكة وكشط مرة أخيرة. بعد ذلك، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل تعليق الخلية إلى قارورة معقمة. غسل الشبكة ومصفاة الخلية مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة، ونقل برنامج تلفزيوني إلى القارورة أيضا.قبل المضي قدما السماح تعليق الخلية بقية على مقاعد البدلاء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع منخلًا معمّمًا 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة من 50 ملليلتر. نقل بلطف تعليق الخلية على المنخل مع ماصة 10 ملليلتر.إذا كان المنخل مسدودًا ، استخدم الجزء الخلفي من طرف ماصة معقمة من ميلي واحد لتكشط الخلايا من خلال المنخل. تغيير منخل كلما لزم الأمر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي، تخلص من المغرور. إعادة تعليق بيليه عن طريق النقر بلطف على القارورة، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في 35 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. لإكمال المرحلة الأولى من عزل الخلايا، ضع منخلًا جديدًا سعة 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة ونقل تعليق الخلية إليها مع ماصة 10 ملليلتر.للحصول على حل أكثر وضوحاً للخلايا، ابدأ بإضافة 15 ملليلتر من متوسط تدرج الكثافة إلى قارورة جديدة بـ 50 ملليلتر. صب حل TMC على رأس متوسطة التدرج الكثافة، مع الحرص على تقليل الاختلاط. بعد ذلك، الطرد المركزي الحل في 1000 مرات ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تسارع والفرامل قبالة.بعد إزالة القارورة من جهاز الطرد المركزي، استخدم ماصة 10 ملليلتر لإزالة الطبقة العليا والتخلص منها. لا تزعج الواجهة بين TMCs ومتوسط التدرج الكثافة. ثم قم بإزالة TMCs مع طرف ماصة مليلتر واحد معقمة ونقلها إلى قارورة جديدة 50 ملليلتر.لغسل الخلايا، أولا إضافة 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الأبقار الجنينية 2٪ و 2 ملليمولار EDTA. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 250 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. غسل الخلايا مرة أخرى، ولكن هذه المرة الطرد المركزي الأنبوب في 400 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.إعداد R10 ثقافة المتوسطة من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10٪ FBS المعطلة الحرارة, 2 ملليمولار L-الجلوتامين, والمحلول المضاد الحيوي. إعادة تعليق TMCs في 10 ملليلتر R10. ثم عد الخلايا.يمكن استخدام الخلايا على الفور أو تجميدها للاستخدام المستقبلي كما هو موضح في المخطوطة. وكانت TMCs ملطخة، المحتضنة بالأجسام المضادة، وتتميز باستخدام عملية استئصال الانسياب. تحتوي TMCs على جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في الخلايا أحادية النوى الطرفية من الدم، وهي مختصرة PMBC.ومع ذلك، كانت ترددات جميع أنواع الخلايا، باستثناء الخلايا B، أقل في اللجان عبر الوطنية منها في PBMCs. لدراسة تنشيط الخلايا في إنتاج السيتوكين، تم تحفيز TMCs بين عشية وضحاها مع resiquimod R848. وأنتجت شركات التكريم، المرسومة باللون الأزرق، جميع السيتوكينات التي تم اختبارها باستثناء IFN Lambda 2/3 و IL-8، على الرغم من أن الإنتاج كان أقل مما هو عليه في PBMCs، الذي تم تخطيطه باللون الأخضر.ويلاحظ أضعاف الزيادات مقارنة التحفيز R848 إلى أي التحفيز في الحمراء. تم تحفيز الكتل المنقية والمعزولة TMCs، الأزرق، وتكتلات الأنسجة اللوزتين، البرتقالي، لمدة 24 ساعة مع فيروس الأنفلونزا A، IAV. تم الكشف عن إنتاج IFN في TMCs ولكن ليس في تراكب كتل الأنسجة مما يشير إلى أن الخلايا اكراميات الأنسجة ليست أفضل نموذج لدراسة إفراز السيتوكين وتنشيط الخلايا.بعد الحضانة المسبقة مع الدواء السام C1 والتحفيز مع R848 ، تم فحص TMCs و PBMCs لمقومات البقاء. وكانت الشركات عبر الوطنية أكثر حساسية إزاء جيم 1. وهذا يشير إلى أن الأدوية الجديدة في العلاجات المستقبلية يجب أن تختبر في الخلايا من الأنسجة، وليس فقط على خطوط الخلايا، PBMCs، أو explants الأنسجة. هذا الإجراء يسمح لنا لاستخدام TMCs مثل PBMCs من الدم كله وإجراء نفس التجارب الخلوية مثل تنقية نوع خلية معينة، وثقافة الخلية، تدفق cytometry أو تجميد.إنعاليات TMCs تجعل من الممكن أن تميز بشكل أفضل، في نموذج ذي صلة، الاستجابة المناعية في الأعضاء اللمفاوية الثانوية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...