Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenterne og N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. anerkender støtte fra ANRS for Fellowship (AAP 2016 1), Den Europæiske Molekylærbiologi Organisation EMBO for Fellowship (LT 834 2017), opstart finansieringsprogrammet "Baustein" af det medicinske fakultet ulm Universitet (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Prøverne indsamles ikke specifikt til forskningsformål, og undersøgelsen betragtes ikke som invasiv. Men indsamling af mandler til mennesker kræver etisk godkendelse fra de lokale relevante myndigheder. I vores tilfælde blev det godkendt af Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Desuden anmodes der om samtykke fra hver patient eller juridisk repræsentant til at indhente donorernes personoplysninger (f.eks. køn, alder, historie af ENT-infektioner), som kan hjælpe med at fortolke eksperi...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Menneskelige mandler repræsenterer en integrativ og fysiologisk ex vivo model til at studere medfødte immunrespons på slimhinden interface, fordi de efterligner den rolle, som en sekundær lymfoide organ. Det er interessant, den cellulære sammensætning af TPC'er svarer til PBMCs og omfatter alle de store cellepopulationer, selv om deres procentdel kan være forskellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Yderligere populationer kan også findes, da alle immunresponser påbegyndes i væv (slimh...

Undersøgelser af menneskelige organer er begrænset på grund af tilgængelighed samt indlysende etiske årsager. Men de er afgørende for fuldt ud at forstå kompleksiteten af den menneskelige biologi. Kulturer af isolerede celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologiundersøgelser på grund af deres tilgængelighed. Mens isolerede cellekulturer har tilladt fremragende opdagelser, er brugen af cellelinjer kommet nærmere undersøgt, fordi de ikke fuldt ud efterligner in vivo orgelbiologi. Men kulturen i tre-dimensionelle celler eller væv explants er meget kompleks4,5,6. Faktisk er et stykke væv eller organ meget heterogent, fordi dets cellesammensætning varierer afhængigt af lokaliseringen i vævet. Således, ved hjælp af væv blokke kræver analyse af mange tekniske og biologiske replikater, hvilket fører til behovet for et stort antal donorer eller patienter.
Den slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) er strukturelt ligner lymfeknuder, men har unikke funktioner, fordi deres vigtigste rolle er at regulere slimhinde immunitet7. I modsætning til lymfeknuderne, som normalt er placeret i en vis afstand fra vævene, er MALT generelt placeret umiddelbart under slimhindevævets epitel. Histologisk består de hovedsageligt af høje koncentrationer af B- og T-celler, men også antigenoppræsendende celler som makrofager og dendritiske celler. MALT udgør omkring 50% af lymfoide væv i den menneskelige krop. MALT er opdelt i ni grupper afhængigt af deres placering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strubehoved-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiseret) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsagelig af mandlerne fra Waldeyers tonsillarrring og er den mest tilgængelige MALT8,9. Tonsiller i oropharynx udgør den største barriere, der beskytter fordøjelsessystemet og luftvejene mod (potentielle) invasive mikroorganismer10. Desuden er mandlerne dækket af en fin stratificeret planocelløs ikke-keratinizing epitel, understøttet af en kapsel bindevæv, der indeholder blodkar, nerver og lymfeknuder, giver nem adgang til immuncellerne11,12. Endvidere, tonsillektomi, den kirurgiske handling at fjerne mandler, er en fælles procedure, der udføres på børn, der har søvn-uorden vejrtrækning, hvilket gør mandler en let tilgængelig væv13 i fysiologiske indstillinger.
Mandler tillader undersøgelse af immuncellerespons i patologier, der involverer slimhindeimmunitet. Faktisk, i hiv-infektion, fordi mandler er sammensat af en høj koncentration af immunceller, de er det vigtigste mål for viral replikation, men også producere en stor mængde cytokiner, der ikke er påvist icirkulationen 14,15. På steady stater, sjældne populationer af medfødte-lignende celler er til stede i forskellige slimhindevæv, herunder mandler, men er hovedsagelig fraværende fra blod.
Således mononukleare celler fra mandler (TMCs) er en mere relevant og kompleks model end PBMCs og kan besvare mere dybtgående spørgsmål. På den anden side kan brugen af vævs explants være kompleks og ikke altid relevant for medfødte immunundersøgelser. Således har vi etableret en model til at studere slimhinde immun aktivering ved hjælp af TMCs16. Her beskriver vi en metode til effektiv isolering af TPC'er fra friske menneskelige mandler. Denne metode gør det muligt at inddrive et stort antal immunceller og samtidig bevare deres integritet for ex vivo undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Undersøgelse af isolerede celler fra slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) giver mulighed for forståelse af immunceller respons i patologier involverer slimhinde immunitet, fordi de kan modellere vært-patogen interaktioner i vævet. Mens isolerede celler stammer fra væv var den første cellekultur model, deres anvendelse er blevet forsømt, fordi væv kan være svært at opnå. I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler (TPC' er) fra sunde menneskelige mandler til at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv. Isolering af TPC'ere fra mandlerne er hurtig, fordi mandlerne knap nok har nogen epitel og udbytte op til milliarder af alle større immuncelletyper. Denne metode gør det muligt at påvise cytokinproduktion ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR, mikroskopi, flowcytometri osv., svarende til brugen af perifere mononukleare celler (PBMCs) fra blod. Desuden, TPC'ere viser en højere følsomhed over for test af lægemidler end PBMCs, som skal overvejes for fremtidige toksicitet assays. Således ex vivo TMCs kulturer er en nem og tilgængelig slimhindemodel.

Vi først karakteriseret immunprofilen af celler til stede i kulturen og analyseret mængden af TPC'er. Vi fænotypede TPC'erne fra mandler med flowcytometri. Som vist i figur 1var alle større immuncelletyper, der foregav i PBMCs fra blod, repræsenteret i TPC'erne fra mandler. I TPC'er var hyppigheden af alle celletyper, undtagen B-celler, dog lavere end i PC'er.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler fra raske mennesker, der gennemgår delvis kirurgisk tonsillektomi for at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv.

Isolering af tonsillar mononukleare celler til at studere Ex Vivo medfødte immunrespons i en human slimhinde lymfoide væv

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsillar mononukleare celler er mere relevante og komplekse end blodlegemer, og deres isolation tillader undersøgelse af immuncellerespons i patologier, der involverer slimhindeimmunitet. Den teknik, vi har etableret tillader inddrivelse af et stort antal immunceller fra en slimhindevæv og samtidig holde deres integritet for ex vivo undersøgelser. Metoden er ganske ligetil, men mandlerne skal håndteres hurtigt og med omhu for at maksimere udbyttet.Transport af det menneskelige tonsillarvæv til laboratoriet som beskrevet i manuskriptteksten. Dernæst placere cellen si på en 150 af 25 millimeter kultur parabol. Læg alle dissektionsinstrumenterne i en anden skål for at holde dem sterile.Alle dine hovedprøver skal håndteres med forsigtighed, da de ikke tidligere har været kvalificerede og kan indeholde infektiøse agenser. Hæld derefter PBS fra hætteglasset i en si, fordi det vil indeholde nogle celler, der har udtrene mandlerne. Brug sterile kraftbecer, overføre mandlerne fra hætteglasset ind i kulturskålen ved hjælp af sterile kraftbecer.Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje mere PBS for at nedsænke gitteret. Dissektionen vil tage omkring 45 minutter per tonsil. Det er afgørende, at mandlerne i løbet af denne tid er nedsænket for at sikre god levedygtighed og celleudbytte.Fjern ætset blodigt og fibroid væv ved hjælp af scesk og en skalpel. Brug skalpel og den buede pincet, skæres vævet i små stykker på mindre end en halv centimeter i diameter. Skær alt vævet, så de små stykker kan nedsænkes på alle tidspunkter.Placer et par stykker væv i cellestingen. Skrab dem på nettet med et glas støder, indtil kun et meget tyndt lag af hvid stroma tilbage. Fjern og kassér stroma for at undgå tilstopning af nettet.Brug derefter en 10-milliliter pipette til at overføre celleaffjedringen på gitteret og skrabe den en sidste gang. Brug derefter en 10-milliliter pipette til at overføre cellesuspensionen til et sterilt hætteglas. Vask gitteret og cellestuden med PBS én gang, og overfør også PBS til hætteglasset.Lad celleaffjedringen hvile på bænken i fem minutter ved stuetemperatur, før du fortsætter. Anvend en steril 70-mikrometersle på toppen af et nyt hætteglas med 50 milliliter. Overfør forsigtigt celleophænget på sien med en pipette på 10 milliliter.Hvis sien er tilstoppet, skal du bruge bagsiden af en steril pipettespids med en milliliter til at skrabe cellerne gennem sien. Skift sigte så ofte som nødvendigt. Centrifuge cellerne ved 250 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Efter centrifugering kasseres supernatanten. Re-suspendere pellet ved forsigtigt at banke hætteglasset, og derefter re-suspendere cellerne i 35 milliliter PBS. For at fuldføre den første fase af celleisolering, placere en ny 70-mikrometer sigte på toppen af et nyt hætteglas og overføre celle suspension på det med en 10-milliliter pipette.For at opnå en klarere celleopløsning skal du begynde med at tilsætte 15 milliliter et tæthedsgradientmedium til et nyt hætteglas med 50 milliliter. Hæld TMC-opløsningen oven på tæthedens gradientmedium, og vær omhyggelig med at minimere blanding. Dernæst centrifugeres opløsningen ved 1000 gange g i 30 minutter ved stuetemperatur med acceleration og bremse fra.Når hætteglasset er fjernet fra centrifugen, skal du bruge en pipette på 10 milliliter til at fjerne og kassere det øverste lag. Forstyr ikke grænsefladen mellem TC'erne og tæthedens gradientmedium. Fjern derefter TC'erne med den sterile pipettespids med en milliliter og overfør dem til et nyt hætteglas med 50 milliliter.For at vaske cellerne tilsættes først 50 milliliter PBS indeholdende 2% føtalt kvægserum og 2 millimolar EDTA. Derefter centrifuge røret ved 250 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Vask cellerne igen, men denne gang centrifuge røret ved 400 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Forbered R10 kultur medium ved at supplere RPMI 1640 med 10% varme-inaktiveret FBS, 2 millimolar L-glutamin, og antibiotika opløsning. TPC'erne suspenderes igen i 10 milliliter R10. Så tælle cellerne.Cellerne kan enten bruges med det samme eller fryses til fremtidig brug som beskrevet i manuskriptet. TC'er blev farves, inkuberet med antistoffer, og karakteriseret ved hjælp af flow cytometri. TC'er indeholdt alle de store immuncelletyper til stede i perifere mononukleare celler fra blod, forkortet PMBC.Hyppigheden af alle celletyper, undtagen B-celler, var imidlertid lavere i T TMC end i PBPC'er. For at studere celleaktivering i cytokinproduktion blev TC'er stimuleret natten over med resiquimod R848. TC'er, afbildet i blåt, produceret alle cytokiner testet undtagen IFN Lambda 2 / 3 og IL-8, selv om produktionen var lavere end i PBMCs, afbildet i grønt.Folden øger sammenligne R848 stimulation til ingen stimulation er noteret i rødt. Rensede og isolerede TC'er, blå og tonsillar væv blokke, orange, blev stimuleret i 24 timer med Influenza A-virus, IAV. IFN produktion blev påvist i TVIS'er, men ikke i supernatant af væv blokke angiver, at væv explants ikke er den bedste model for studiet af cytokin sekretion og celle aktivering.Efter præinkubation med det giftige lægemiddel C1 og stimulering med R848 blev TC'er og PBPC'er analyseret for levedygtighed. TC'erne var mere følsomme over for C1. Dette tyder på, at nye lægemidler i fremtidige behandlinger bør testes i celler fra væv, ikke kun på cellelinjer, PBPC'er, eller væv explants. Denne procedure giver os mulighed for at bruge TPC'er som PBM'er fra fuldblod og til at udføre de samme cellulære eksperimenter såsom rensning af en bestemt celletype, cellekultur, flow cytometri eller frysning.Isolationer af T TMC'er gør det muligt bedre at karakterisere immunresponset i sekundære lymfoide organer i patologier, der involverer slimhindeimmunitet, bedre.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering af fedtvæv immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøveudtagning af slimhindebelægning væske til kvantificering af In Vivo øvre luftveje immun-mægler niveauer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion af menneskelige lymfoide væv og kvindelige kønsorganer slimhinde med Human immundefekt Virus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge Blister protokol at studere Human T-celle hjemkalde svar In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En barciak Oral Administration Model til Study Commensal-Induced medfødte immunrespons

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo Assay at studere Candida albicans Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...