Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) voor de experimenten en N.B. fellowship (AAP 2017 166). N.S. erkent steun van de ANRS for fellowship (AAP 2016 1), de European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), het startup funding programma "Baustein" van de Medische Faculteit van de Universiteit van de Universiteit van de Universiteit (LSBN.0147) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).

De specimens worden niet specifiek verzameld voor onderzoeksdoeleinden en de studie wordt niet als invasief beschouwd. Echter, menselijke amandelen collectie vereist ethische goedkeuring door de lokale relevante autoriteiten. In ons geval is het goedgekeurd door het Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Bovendien wordt toestemming van elke patiënt of wettelijke vertegenwoordiger gevraagd om persoonsgegevens van donoren (bijvoorbeeld geslacht, leeftijd, geschiedenis van KNO-infecties) te verk...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Menselijke amandelen vertegenwoordigen een integratief en fysiologisch ex vivo-model om aangeboren immuunreacties te bestuderen op de slijmkoselsinterface, omdat ze de rol van een secundair lymfoïde orgaan nabootsen. Interessant is dat de cellulaire samenstelling van de TMC's vergelijkbaar is met de PBMCs en alle grote celpopulaties omvat, hoewel hun percentage kan verschillen van PBMCs van bloed(figuur 1). Extra populaties kunnen ook worden gevonden, omdat alle immuunreacties worden geïni...

Studies over menselijke organen zijn beperkt als gevolg van toegankelijkheid en voor de hand liggende ethische redenen. Ze zijn echter essentieel om de complexiteit van de menselijke biologie volledig te begrijpen. Culturen van geïsoleerde cellen (primaire culturen of cellijnen) zijn een standaardsysteem in celbiologiestudies vanwege hun beschikbaarheid. Terwijl geïsoleerde celculturen hebben toegestaan uitstekende ontdekkingen, het gebruik van cellijnen is gekomen op nadere toetsing, omdat ze niet volledig na te bootsen in vivo orgaanbiologie. De cultuur van driedimensionale cellen of weefselexplants is echter zeer complex4,5,6. Inderdaad, een stuk weefsel of orgaan is zeer heterogeen omdat de celsamenstelling verschilt afhankelijk van de lokalisatie in het weefsel. Dus, het gebruik van weefselblokken vereist de analyse van vele technische en biologische replicaties, wat leidt tot de noodzaak van een groot aantal donoren of patiënten.
De slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) zijn structureel vergelijkbaar met de lymfeklieren, maar hebben unieke functies, omdat hun belangrijkste rol is het reguleren van slijmvliesimmuniteit7. In tegenstelling tot de lymfeklieren, die zich meestal op enige afstand van de weefsels bevinden, bevindt MALT zich over het algemeen direct onder het epitheel van het slijmvliesweefsel. Histologisch gezien bestaan ze voornamelijk uit hoge concentraties B- en T-cellen, maar ook antigeen-presenterende cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. MOUT vormen ongeveer 50% van het lymfeweefsel in het menselijk lichaam. Mout is onderverdeeld in negen groepen, afhankelijk van hun locatie: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasale-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (georganiseerd) en D-MALT (diffuus). De O-MALT bestaat voornamelijk uit de amandelen van Waldeyer's tonsillaire ring en is de meest toegankelijke MALT8,9. Inderdaad, amandelen in de oropharynx vormen de belangrijkste barrière ter bescherming van de spijsvertering en luchtwegen tegen (potentiële) invasieve micro-organismen10. Bovendien worden de amandelen bedekt met een fijne gelaagde plaveisel niet-keratiniserend epitheel, ondersteund door een capsule bindweefsel dat bloedvaten, zenuwen en lymfotica bevat, waardoor gemakkelijk toegang is tot de immuuncellen11,12. Bovendien is tonsillectomie, de chirurgische handeling van het verwijderen van amandelen, een veel voorkomende procedure uitgevoerd bij kinderen met slaapstoornissen ademhaling, waardoor amandelen een gemakkelijk beschikbaar weefsel13 in fysiologische instellingen.
Tonsils maken de studie van immuuncelrespons in pathologieën met betrekking tot mucosale immuniteit mogelijk. Inderdaad, bij hiv-infectie, omdat amandelen zijn samengesteld uit een hoge concentratie van immuuncellen, ze zijn het belangrijkste doelwit van virale replicatie, maar produceren ook een grote hoeveelheid cytokinen die niet worden gedetecteerd in de circulatie14,15. In stabiele toestanden zijn zeldzame populaties van aangeboren cellen aanwezig in verschillende slijmvliesweefsels, waaronder de amandelen, maar zijn in wezen afwezig in bloed.
Mononucleaire cellen uit amandelen (TMC's) zijn dus een relevanter en complexer model dan PBMC's en kunnen diepgaandere vragen beantwoorden. Aan de andere kant kan het gebruik van weefselexplants complex zijn en niet altijd relevant voor aangeboren immuunstudies. Zo hebben we een model opgesteld om mucosale immuunactivering te bestuderen met behulp van TMC's16. Hier beschrijven we een methode voor een efficiënte isolatie van TMC's van verse menselijke amandelen. Deze methode maakt het herstel van een groot aantal immuuncellen mogelijk terwijl hun integriteit behouden blijft voor ex vivo-studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Het bestuderen van geïsoleerde cellen uit slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) maakt het mogelijk om de respons van immuuncellen in pathologieën met mucosale immuniteit te begrijpen, omdat ze gastheerpathogenische interacties in het weefsel kunnen modelleren. Terwijl geïsoleerde cellen afkomstig van weefsels waren de eerste cel cultuur model, het gebruik ervan is verwaarloosd omdat weefsel kan moeilijk te verkrijgen. In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen (TMC's) verwerken en kweken van gezonde menselijke amandelen om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in slijmvliesweefsels nabootst. Isolatie van TMC's uit de amandelen is snel, omdat de amandelen nauwelijks epitheel hebben en tot miljarden van alle grote immuunceltypes opleveren. Deze methode maakt detectie van cytokine productie met behulp van verschillende technieken, waaronder immunoassays, qPCR, microscopie, flow cytometrie, enz., vergelijkbaar met het gebruik van perifere mononucleaire cellen (PBMCs) uit bloed. Bovendien vertonen TMC's een hogere gevoeligheid voor geneesmiddelentests dan PBMCs, waarmee rekening moet worden gehouden met toekomstige toxiciteitstests. Ex vivo TMC-culturen zijn dus een eenvoudig en toegankelijk slijmvliesmodel.

We kenmerkten eerst het immuunsysteem profiel van cellen aanwezig in de cultuur en analyseerden de hoeveelheid TMC's. We phenotyped de TMC's van amandelen met flow cytometrie. Zoals blijkt uit figuur 1,waren alle belangrijke immuunceltypen die in PBMC's in bloed aanwezig waren, in de TMC's van amandelen. In TMC's was de frequentie van alle celtypen, behalve B-cellen, echter lager dan in PBMC's.
<img...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsillaire mononucleaire cellen zijn relevanter en complexer dan bloedcellen, en hun isolatie maakt de studie van immuuncelrespons in pathologieën met betrekking tot mucosale immuniteit mogelijk. De techniek die we hebben vastgesteld maakt het herstel van een groot aantal immuuncellen uit een slijmvliesweefsel mogelijk terwijl ze hun integriteit behouden voor ex vivo-studies. De methode is vrij eenvoudig, maar de amandelen moeten snel en met zorg worden behandeld om de opbrengst te maximaliseren.Vervoer het menselijke tonsillaire weefsel naar het laboratorium zoals beschreven in de manuscripttekst. Plaats vervolgens de celzeef op een 150 bij 25 millimeter kweekschotel. Plaats alle dissectie instrumenten in een ander gerecht om ze steriel te houden.Al uw belangrijkste exemplaren moeten met zorg worden behandeld omdat ze niet eerder zijn gekwalificeerd en besmettelijke agentia kunnen bevatten. Giet vervolgens de PBS uit de flacon in een zeef, omdat het een aantal cellen zal bevatten die de amandelen hebben uitgestoten. Met behulp van steriele tangen, breng de amandelen van de flacon in de cultuur schotel met behulp van steriele tangen.Voeg indien nodig meer PBS toe om het raster onder te dompelen. De dissectie duurt ongeveer 45 minuten per ton. Het is van cruciaal belang dat gedurende deze tijd de amandelen worden ondergedompeld om een goede levensvatbaarheid en celopbrengsten te garanderen.Verwijder cauterized bloederige en vleesboom weefsel met behulp van tangen en een scalpel. Met behulp van de scalpel en de gebogen pincet, snijd het weefsel in kleine stukjes van minder dan een halve centimeter in diameter. Snijd al het weefsel, zodat de kleine stukjes te allen tijde kunnen worden ondergedompeld.Plaats een paar stukjes weefsel in de celzeef. Schraap ze op het rooster met een glazen stamper tot slechts een zeer dunne laag witte stroma overblijft. Verwijder en gooi de stroma weg om te voorkomen dat het raster verstopt raakt.Gebruik vervolgens een pipet van 10 milliliter om de celopsusopening op het rooster over te brengen en deze nog een laatste keer te schrapen. Gebruik vervolgens een pipet van 10 milliliter om de celsuspensie over te zetten in een steriele flacon. Was het rooster en de celzeef een keer met PBS en breng de PBS ook over naar de flacon.Voordat u verder gaat laat de celsuspensie vijf minuten rusten op de bank bij kamertemperatuur. Plaats een steriele zeef van 70 micrometer bovenop een nieuwe flacon van 50 milliliter. Breng de celopening voorzichtig over op de zeef met een pipet van 10 milliliter.Als de zeef verstopt is, gebruik dan de achterkant van een steriele pipetpunt van één milliliter om de cellen door de zeef te schrapen. Verander de zeef zo vaak als nodig is. Centrifugeren de cellen op 250 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Na centrifugatie, gooi de supernatant. Stel de pellet opnieuw op door voorzichtig op de flacon te tikken en schort de cellen vervolgens opnieuw op in 35 milliliter PBS. Om de eerste fase van celisolatie te voltooien, plaatst u een nieuwe zeef van 70 micrometer bovenop een nieuw flesje en breng u de celopening erop met een pipet van 10 milliliter.Om een duidelijkere celoplossing te verkrijgen, begin met het toevoegen van 15 milliliter van een dichtheidsgradiëntmedium aan een nieuwe 50-milliliter flacon. Giet de TMC-oplossing bovenop het dichtheidsgradiëntmedium, waarbij u voorzichtig bent met het minimaliseren van het mengen. Vervolgens u de oplossing 30 minuten lang op 1000 g bij kamertemperatuur centrifugeren met acceleratie en afremmen.Na het verwijderen van de flacon uit de centrifuge, gebruik een 10-milliliter pipet te verwijderen en gooi de bovenste laag. Verstoor de interface tussen de TMC's en het dichtheidsgradiëntmedium niet. Verwijder vervolgens de TMC's met de steriele pipettip van één milliliter en breng ze over naar een nieuwe flacon van 50 milliliter.Om de cellen te wassen, voeg eerst 50 milliliter PBS toe die 2%foetaal runderserum en 2 millimolar EDTA bevat. Dan centrifugeren de buis op 250 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Was de cellen opnieuw, maar deze keer centrifugeren de buis op 400 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Bereid R10-kweekmedium voor door RPMI 1640 aan te vullen met 10%warmte-geïnactiveerde FBS, 2 millimolar L-glutamine en de antibioticaoplossing. Stel de TMC's opnieuw op in 10 milliliter R10. Tel dan de cellen.De cellen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bevroren voor toekomstig gebruik zoals beschreven in het manuscript. TMC's werden bevlekt, geïncubeerd met antilichamen, en gekenmerkt met behulp van stroom cytometrie. TMC's bevatten alle belangrijke immuunceltypes aanwezig in perifere mononucleaire cellen uit bloed, afgekort PMBC.De frequenties van alle celtypen, met uitzondering van B-cellen, waren echter lager in TMC's dan in PBMC's. Om celactivering in cytokineproductie te bestuderen, werden TMC's 's nachts gestimuleerd met resiquimod R848. TMC's, uitgezet in blauw, produceerden alle geteste cytokinen, met uitzondering van IFN Lambda 2/3 en IL-8, hoewel de productie lager was dan in PBMC's, uitgezet in het groen.De vouw verhoogt het vergelijken van R848 stimulatie aan geen stimulatie worden opgemerkt in rood. Gezuiverde en geïsoleerde TMC's, blauwe en tonsillaire weefselblokken, oranje, werden gedurende 24 uur gestimuleerd met influenza A-virus, IAV. IFN productie werd gedetecteerd in TMC's, maar niet in de supernatant van de weefselblokken waaruit blijkt dat weefsel explants zijn niet het beste model voor de studie van cytokine afscheiding en cel activering.Na pre-incubatie met het giftige medicijn C1 en stimulatie met R848 werden TMC's en PBMC's onderzocht op levensvatbaarheid. TMC's waren gevoeliger voor C1. Dit suggereert dat nieuwe geneesmiddelen in toekomstige behandelingen moeten worden getest in cellen uit weefsels, niet alleen op cellijnen, PBMC's of weefselexplants. Deze procedure stelt ons in staat om de TMC's zoals PBMCs uit volbloed te gebruiken en dezelfde cellulaire experimenten uit te voeren, zoals zuivering van een specifiek celtype, celkweek, stroomcytometrie of bevriezing.Isolatieen van TMC's maken het mogelijk om in een relevant model de immuunrespons in secundaire lymfoïdeorganen in pathologieën met mucosale immuniteit beter te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...