Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Agence nationale de la recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) pour les expériences et la bourse du N.-B. (AAP 2017 166). N.S. reconnaît le soutien de l’ANRS pour la bourse (AAP 2016 1), de l’Organisation européenne de biologie moléculaire EMBO for Fellowship (LT 834 2017), du programme de financement de démarrage « Baustein » de la Faculté de médecine de l’Université d’Ulm (LSBN.0147) et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Les spécimens ne sont pas recueillis spécifiquement à des fins de recherche et l’étude n’est pas considérée comme envahissante. Toutefois, la collecte des amygdales humaines nécessite l’approbation éthique des autorités locales compétentes. Dans notre cas, il a été approuvé par le Comité de protection des personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). De plus, le consentement de chaque patient ou représentant légal est demandé pour obtenir les données personnelles des donneurs (p. ex., sexe, âge, anté...

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Les amygdales humaines représentent un modèle ex vivo intégratif et physiologique pour étudier les réponses immunitaires innées à l’interface muqueuse, parce qu’elles imitent le rôle d’un organe lymphoïde secondaire. Fait intéressant, la composition cellulaire des TMC est similaire aux PBMC et comprend toutes les principales populations de cellules, bien que leur pourcentage puisse être différent des PBMC du sang (figure 1). D’autres populations peuvent également être t...

Les études sur les organes humains sont limitées en raison de l’accessibilité ainsi que des raisons éthiques évidentes. Cependant, ils sont essentiels pour bien comprendre la complexité de la biologie humaine. Les cultures de cellules isolées (cultures primaires ou lignées cellulaires) sont un système standard dans les études de biologie cellulaire en raison de leur disponibilité. Bien que les cultures cellulaires isolées aient permis des découvertes exceptionnelles, l’utilisation de lignées cellulaires a fait l’objet d’un examen plus approfondi parce qu’elles n’imitent pas entièrement la biologie in vivo des organes. Cependant, la culture des cellules tridimensionnelles ou des explants de tissu est très complexe4,5,6. En effet, un morceau de tissu ou d’organe est fortement hétérogène parce que sa composition cellulaire diffère selon la localisation dans le tissu. Ainsi, l’utilisation de blocs de tissus nécessite l’analyse de nombreuses répliques techniques et biologiques, conduisant à la nécessité d’un grand nombre de donneurs ou de patients.
Les tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) sont structurellement semblables aux ganglions lymphatiques, mais ont des fonctions uniques, parce que leur rôle principal est de réguler l’immunité muqueuse7. Contrairement aux ganglions lymphatiques, qui sont généralement situés à une certaine distance des tissus, MALT sont généralement situés immédiatement en dessous de l’épithélium du tissu muqueuse. Histologiquement, ils sont principalement composés de fortes concentrations de cellules B et T, mais aussi de cellules présentant des antigènes telles que les macrophages et les cellules dendritiques. MALT constituent environ 50% du tissu lymphoïde dans le corps humain. Les MALT sont subdivisés en neuf groupes selon leur emplacement : GALT (intestin-), BALT (bronches-), NALT (nasal-), CALT (conjonctival), LALT (larynx-), SALT (peau-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisé) et D-MALT (diffusé). L’O-MALT est principalement composé des amygdales de l’anneau amygdale de Waldeyer et est le malt le plus accessible8,9. En effet, les amygdales situées dans l’oropharynx constituent la principale barrière protégeant les voies digestives et respiratoires contre les micro-organismes (potentiels) invasifs10. En outre, les amygdales sont couvertes par un épithélium squameux non kératinisant stratifié fin, soutenu par une capsule de tissu conjonctif contenant des vaisseaux sanguins, les nerfs et les lymphatiques, offrant un accès facile aux cellules immunitaires11,12. En outre, l’amygdalectomie, l’acte chirurgical d’enlever les amygdales, est une procédure courante effectuée sur les enfants ayant une respiration trouble du sommeil, ce qui rend les amygdales un tissu facilement disponible13 dans les milieux physiologiques.
Les amygdales permettent l’étude de la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse. En effet, dans l’infection par le VIH, parce que les amygdales sont composées d’une forte concentration de cellules immunitaires, ils sont la cible principale de la réplication virale, mais produisent également une grande quantité de cytokines qui ne sont pas détectés dans la circulation14,15. À des états stables, de rares populations de cellules innées sont présentes dans divers tissus muqueuses, y compris les amygdales, mais sont essentiellement absentes du sang.
Ainsi, les cellules mononucléaires des amygdales (TMC) sont un modèle plus pertinent et complexe que les PBMC et peuvent répondre à des questions plus profondes. D’autre part, l’utilisation d’explants de tissu peut être complexe et pas toujours pertinente pour les études immunitaires innées. Ainsi, nous avons établi un modèle pour étudier l’activation immunitaire muqueuse à l’aide de TMCs16. Ici, nous décrivons une méthode pour l’isolement efficace des TMCs des amygdales humaines fraîches. Cette méthode permet la récupération d’un grand nombre de cellules immunitaires tout en gardant leur intégrité pour les études ex vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

L’étude des cellules isolées des tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) permet de comprendre la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse, car elles peuvent modéliser les interactions hôte-pathogène dans le tissu. Alors que les cellules isolées dérivées des tissus étaient le premier modèle de culture cellulaire, leur utilisation a été négligée parce que les tissus peuvent être difficiles à obtenir. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdales (TMCs) à partir d’amygdales humaines saines pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses. L’isolement des TMCs des amygdales est rapide, parce que les amygdales ont à peine de l’épithélium et de produire jusqu’à des milliards de tous les principaux types de cellules immunitaires. Cette méthode permet la détection de la production de cytokines à l’aide de plusieurs techniques, y compris les immunotests, qPCR, microscopie, cytométrie de flux, etc., semblables à l’utilisation de cellules mononucléaires périphériques (PBMC) à partir du sang. De plus, les CTM présentent une plus grande sensibilité aux tests de dépistage des drogues que les PBMC, qui doivent être prises en considération pour les futurs tests de toxicité. Ainsi, les cultures ex vivo TMCs sont un modèle muqueuse facile et accessible.

Nous avons d’abord caractérisé le profil immunitaire des cellules présentes dans la culture et analysé la quantité de TMCs. Nous avons phénypique les TMC des amygdales avec la cytométrie de flux. Comme le montre la figure 1, tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les PBMC provenant du sang étaient représentés dans les TMC à partir d’amygdales. Toutefois, dans les TMC, la fréquence de tous les types de cellules, à l?...

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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Dans le protocole actuel, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdaler des humains sains subissant l’amygdalectomie chirurgicale partielle pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses.

Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Les cellules mononucléaires amygdales sont plus pertinentes et complexes que les cellules sanguines, et leur isolement permet l’étude de la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse. La technique que nous avons établie permet la récupération d’un grand nombre de cellules immunitaires à partir d’un tissu muqueux tout en conservant leur intégrité pour les études ex vivo. La méthode est assez simple, mais les amygdales doivent être manipulées rapidement et avec soin afin de maximiser le rendement.Transportez le tissu amygdale humain au laboratoire tel que décrit dans le texte manuscrit. Ensuite, placez la passoire cellulaire sur un plat de culture de 150 x 25 millimètres. Placez tous les instruments de dissection dans un autre plat pour les garder stériles.Tous vos échantillons principaux doivent être manipulés avec soin car ils n’ont pas été préalablement qualifiés et peuvent contenir des agents infectieux. Versez ensuite le PBS du flacon dans une passoire, car il contiendra certaines cellules qui ont égressé les amygdales. À l’aide de forceps stériles, transférer les amygdales du flacon dans le plat de culture à l’aide de forceps stériles.Si nécessaire, ajouter plus de PBS pour immerger la grille. La dissection prendra environ 45 minutes par amygdale. Il est crucial que pendant ce temps les amygdales soient submergées pour assurer une bonne viabilité et des rendements cellulaires.Enlever les tissus sanguins et fibromes cautérisés à l’aide de forceps et d’un scalpel. À l’aide du scalpel et de la pince incurvée, couper le tissu en petits morceaux de moins d’un demi-centimètre de diamètre. Couper tous les tissus afin que les petits morceaux puissent être immergés en tout temps.Placez quelques morceaux de tissu dans la passoire cellulaire. Grattez-les sur la grille avec un pilon en verre jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une très fine couche de stroma blanc. Retirer et jeter le stroma pour éviter d’obstruer la grille.Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la suspension cellulaire sur la grille et la gratter une dernière fois. Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la suspension cellulaire dans un flacon stérile. Lavez la grille et la passoire cellulaire avec PBS une fois, et transférez le PBS sur le flacon également.Avant de procéder, laisser reposer la suspension cellulaire sur le banc pendant cinq minutes à température ambiante. Placez un tamis stérile de 70 micromètres sur un nouveau flacon de 50 millilitres. Transférer délicatement la suspension cellulaire sur le tamis avec une pipette de 10 millilitres.Si le tamis est obstrué, utilisez le dos d’une pointe stérile de pipette d’un millilitre pour racler les cellules à travers le tamis. Changez le tamis aussi souvent que nécessaire. Centrifuger les cellules à 250 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Après centrifugation, jeter le supernatant. Suspendez la pastille en tapant doucement sur le flacon, puis suspendez les cellules en 35 millilitres de PBS. Pour terminer la première phase de l’isolement cellulaire, placez un nouveau tamis de 70 micromètres au-dessus d’un nouveau flacon et transférez la suspension cellulaire sur elle avec une pipette de 10 millilitres.Pour obtenir une solution cellulaire plus claire, commencez par ajouter 15 millilitres d’un milieu de gradient de densité à un nouveau flacon de 50 millilitres. Verser la solution TMC sur le dessus du milieu de gradient de densité, en prenant soin de minimiser le mélange. Ensuite, centrifugez la solution à 1000 fois g pendant 30 minutes à température ambiante avec accélération et freinez.Après avoir retiré le flacon de la centrifugeuse, utilisez une pipette de 10 millilitres pour enlever et jeter la couche supérieure. Ne perturbez pas l’interface entre les CMT et le milieu de gradient de densité. Retirez ensuite les CMT avec la pointe stérile de pipette d’un millilitre et transférez-les sur un nouveau flacon de 50 millilitres.Pour laver les cellules, ajoutez d’abord 50 millilitres de PBS contenant 2% de sérum bovin fœtal et 2 millimolaires EDTA. Puis centrifuger le tube à 250 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules à nouveau, mais cette fois centrifuger le tube à 400 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Préparez le milieu de culture R10 en complétant rpmi 1640 avec 10% FBS inactivé par la chaleur, 2 millimolar L-glutamine, et la solution antibiotique. Suspendre à nouveau les CMT en 10 millilitres de R10. Alors comptez les cellules.Les cellules peuvent être utilisées immédiatement ou congelées pour une utilisation future comme décrit dans le manuscrit. Les MCC ont été tachés, incubés avec des anticorps, et caractérisés utilisant la cytométrie de flux. Les CMT contenaient tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les cellules mononucléaires périphériques du sang, abrégées PMBC.Cependant, les fréquences de tous les types de cellules, à l’exception des cellules B, étaient plus faibles dans les MCM que dans les PBMCs. Pour étudier l’activation cellulaire dans la production de cytokine, les CMT ont été stimulés du jour au lendemain avec le resiquimod R848. Les CMT, tracés en bleu, ont produit toutes les cytokines testées à l’exception de l’IFN Lambda 2/3 et de l’IL-8, bien que la production ait été inférieure à celle des PBMC, tracée en vert.Le pli augmente en comparant la stimulation R848 à aucune stimulation sont notés en rouge. Les CMT purifiés et isolés, les blocs de tissus bleus et amygdales, l’orange, ont été stimulés pendant 24 heures par le virus de la grippe A, l’IAV. La production d’IFN a été détectée dans les CMT, mais pas dans le supernatant des blocs tissulaires indiquant que les explantations tissulaires ne sont pas le meilleur modèle pour l’étude de la sécrétion de cytokine et de l’activation cellulaire.Après la pré-incubation avec le médicament toxique C1 et la stimulation avec R848, les CMT et les PMC ont été mis à l’essai pour la viabilité. Les CMT étaient plus sensibles à la C1. Ceci suggère que de nouveaux médicaments dans les futurs traitements devraient être examinés dans les cellules des tissus, pas seulement sur des lignes cellulaires, des PBMCs, ou des explants de tissu. Cette procédure nous permet d’utiliser les MCM comme les PBMCs à partir de sangs entiers et d’effectuer les mêmes expériences cellulaires telles que la purification d’un type cellulaire spécifique, la culture cellulaire, la cytométrie du débit ou le gel.Les isolements des CMT permet de mieux caractériser, dans un modèle pertinent, la réponse immunitaire dans les organes lymphoïdes secondaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sept étapes pour Stellate Cellules

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...