Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) für die Experimente und Das N.B.-Stipendium (AAP 2017 166). N.S. unterstützt das ANRS für Stipendien (AAP 2016 1), die European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), das Startup-Förderprogramm "Baustein" der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm (LSBN.0147) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Die Proben werden nicht speziell für Forschungszwecke gesammelt und die Studie gilt nicht als invasiv. Die Sammlung menschlicher Mandeln bedarf jedoch der ethischen Zustimmung der zuständigen Behörden vor Ort. In unserem Fall wurde es vom Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) genehmigt. Darüber hinaus wird die Zustimmung jedes Patienten oder gesetzlichen Vertreters einzuholen, um die personenbezogenen Daten der Spender (z. B. Geschlecht, Alter, Geschichte von HNO-Infektionen) zu erhalten, ...

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	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Menschliche Mandeln stellen ein integratives und physiologisches Ex-vivo-Modell dar, um angeborene Immunantworten an der Schleimhautschnittstelle zu untersuchen, da sie die Rolle eines sekundären Lymphorgans imitieren. Interessanterweise ist die zelluläre Zusammensetzung der TMCs den PBMCs ähnlich und umfasst alle wichtigen Zellpopulationen, obwohl ihr Prozentsatz von PBMCs aus Blut abweichen kann (Abbildung 1). Zusätzliche Populationen können auch gefunden werden, da alle Immunantworte...

Studien an menschlichen Organen sind aufgrund der Zugänglichkeit sowie offensichtlicher ethischer Gründe eingeschränkt. Sie sind jedoch unerlässlich, um die Komplexität der menschlichen Biologie vollständig zu verstehen. Kulturen isolierter Zellen (Primärkulturen oder Zelllinien) sind aufgrund ihrer Verfügbarkeit ein Standardsystem in zellbiologischen Studien. Während isolierte Zellkulturen hervorragende Entdeckungen ermöglicht haben, ist die Verwendung von Zelllinien genauer unter die Lupe genommen worden, weil sie die in vivo Organbiologie nicht vollständig imitieren. Die Kultur der dreidimensionalen Zellen oder Gewebeexplanten ist jedoch hochkomplex4,5,6. Tatsächlich ist ein Stück Gewebe oder Organ sehr heterogen, da seine Zellzusammensetzung je nach Lokalisierung im Gewebe unterschiedlich ist. Daher erfordert die Verwendung von Gewebeblöcken die Analyse vieler technischer und biologischer Repliken, was zu einer großen Anzahl von Spendern oder Patienten führt.
Die Schleimhaut-assoziierten Lymphgewebe (MALT) sind strukturell den Lymphknoten ähnlich, haben aber einzigartige Funktionen, da ihre Hauptaufgabe darin besteht, die Schleimhautimmunität zu regulieren7. Im Gegensatz zu den Lymphknoten, die sich in der Regel in einiger Entfernung vom Gewebe befinden, befindet sich MALT in der Regel direkt unter dem Epithel des Schleimhautgewebes. Histologisch bestehen sie hauptsächlich aus hohen Konzentrationen von B- und T-Zellen, aber auch aus Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen. MALT machen etwa 50% des Lymphgewebes im menschlichen Körper aus. MALT sind je nach Standort in neun Gruppen unterteilt: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktiv), LALT (Larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisiert) und D-MALT (diffus). Der O-MALT besteht hauptsächlich aus den Mandeln des Waldeyer Tonsillar-Rings und ist der zugänglichste MALT8,9. Tatsächlich stellen Mandeln im Oropharynx die Hauptbarriere zum Schutz der Verdauungs- und Atemwege vor (potenziellen) invasiven Mikroorganismen10dar. Darüber hinaus werden die Mandeln von einem fein geschichteten Plattenepithel ohne Keratinisieren bedeckt, das von einer Kapsel aus Bindegewebe unterstützt wird, die Blutgefäße, Nerven und Lymphatik enthält und einen einfachen Zugang zu den Immunzellen11,12ermöglicht. Darüber hinaus ist die Tonsillektomie, der chirurgische Akt der Entfernung von Mandeln, ein häufiges Verfahren, das bei Kindern mit schlafgestörter Atmung durchgeführt wird, wodurch Mandelnin physiologischen Umgebungen leicht zugänglich sind.
Tonsillen ermöglichen die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. In der Tat, bei HIV-Infektion, weil Mandeln aus einer hohen Konzentration von Immunzellen bestehen, sind sie das Hauptziel der Virusreplikation, sondern produzieren auch eine große Menge an Zytokinen, die nicht im Kreislauf14,15nachgewiesen werden. In stabilen Zuständen sind seltene Populationen von angeborenen Zellen in verschiedenen Schleimhautgeweben vorhanden, einschließlich der Mandeln, aber im Wesentlichen fehlen im Blut.
Daher sind mononukleäre Zellen aus Mandeln (TMCs) ein relevanteres und komplexeres Modell als PBMCs und können tiefergehende Fragen beantworten. Andererseits kann die Verwendung von Gewebeexplantationen komplex und nicht immer relevant für angeborene Immunstudien sein. So haben wir ein Modell zur Untersuchung der Mukosal-Immunaktivierung mit TMCs16erstellt. Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Isolierung von TMCs von frischen menschlichen Mandeln. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Immunzellen unter Beibehaltung ihrer Integrität für Ex-vivo-Studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Die Untersuchung isolierter Zellen aus Mukosa-assoziierten Lymphgeweben (MALT) ermöglicht das Verständnis der Reaktion von Immunzellen in Pathologien mit Schleimhautimmunität, da sie Wirtspathogen-Wechselwirkungen im Gewebe modellieren können. Während isolierte Zellen aus Geweben das erste Zellkulturmodell waren, wurde ihre Verwendung vernachlässigt, da Gewebe schwer zu erhalten sein kann. Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Mandelzellen (TMCs) von gesunden menschlichen Mandeln leicht verarbeiten und kulturieren kann, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen. Die Isolierung von TMCs von den Mandeln ist schnell, da die Mandeln kaum Epithel haben und bis zu Milliarden aller großen Immunzelltypen erwirtschaften. Diese Methode ermöglicht den Nachweis der Zytokinproduktion mit verschiedenen Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw., ähnlich wie bei der Verwendung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Blut. Darüber hinaus weisen TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteltests auf als PBMCs, die bei zukünftigen Toxizitätstests berücksichtigt werden müssen. Daher sind ex vivo TMCs Kulturen ein einfaches und zugängliches Schleimhautmodell.

Wir charakterisierten zunächst das Immunprofil der in der Kultur vorhandenen Zellen und analysierten die Menge der TMCs. Wir phäphierten die TMCs aus Mandeln mit Durchflusszytometrie. Wie in Abbildung 1dargestellt, waren alle wichtigen Immunzelltypen, die in PBMCs aus Blut vorkommen, in den TMCs aus Mandeln dargestellt. Bei TMCs war die Häufigkeit aller Zelltypen mit Ausnahme von B-Zellen jedoch niedriger als bei PBMCs.
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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.

Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsiller mononukleäre Zellen sind relevanter und komplexer als Blutzellen, und ihre Isolierung ermöglicht die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. Die von uns etablierte Technik ermöglicht die Rückgewinnung einer großen Anzahl von Immunzellen aus einem Schleimhautgewebe und behält gleichzeitig ihre Integrität für Ex-vivo-Studien. Die Methode ist recht einfach, aber die Mandeln müssen schnell und mit Sorgfalt behandelt werden, um den Ertrag zu maximieren.Transportieren Sie das menschliche Tonsillergewebe ins Labor, wie im Manuskripttext beschrieben. Als nächstes legen Sie das Zellsieb auf eine 150 mal 25 Millimeter große Kulturschale. Legen Sie alle Sezierinstrumente in ein anderes Gericht, um sie steril zu halten.Alle Ihre Hauptproben sollten mit Vorsicht behandelt werden, da sie noch nicht qualifiziert wurden und Infektionserreger enthalten können. Dann gießen Sie die PBS aus der Durchstechflasche in ein Sieb, weil es einige Zellen enthalten wird, die die Mandeln ausgetreten sind. Mit sterilen Zangen die Mandeln aus der Durchstechflasche mit steriler Zange in die Kulturschale übertragen.Fügen Sie ggf. weitere PBS hinzu, um das Raster einzutauchen. Die Sezierung dauert etwa 45 Minuten pro Tonnen. Es ist entscheidend, dass während dieser Zeit die Mandeln untergetaucht werden, um eine gute Lebensfähigkeit und Zellerträge zu gewährleisten.Entfernen Sie kauterisiertes blutiges und fibroides Gewebe mit Zangen und einem Skalpell. Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell und der gekrümmten Pinzette in kleine Stücke von weniger als einem halben Zentimeter Durchmesser. Schneiden Sie das gesamte Gewebe, so dass die kleinen Stücke jederzeit eingetaucht werden können.Legen Sie ein paar Gewebestücke in das Zellsieb. Schrotten Sie sie mit einem Glasschädling auf das Gitter, bis nur noch eine sehr dünne Schicht weißer Stroma übrig bleibt. Entfernen und verwerfen Sie die Stroma, um eine Verstopfung des Rasters zu vermeiden.Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension auf das Gitter zu übertragen und ein letztes Mal zu kratzen. Als nächstes verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension in eine sterile Durchstechflasche zu übertragen. Waschen Sie das Gitter und das Zellsieb einmal mit PBS und übertragen Sie die PBS auch auf die Durchstechflasche.Bevor Sie fortfahren, lassen Sie die Zellaufhängung fünf Minuten bei Raumtemperatur auf der Bank ruhen. Legen Sie ein steriles 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette auf das Sieb.Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die Rückseite einer sterilen Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Zellen durch das Sieb zu kratzen. Ändern Sie das Sieb so oft wie nötig. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet durch sanftes Tippen auf die Durchstechflasche wieder auf, und setzen Sie die Zellen dann in 35 Milliliter PBS wieder auf. Um die erste Phase der Zellisolierung abzuschließen, legen Sie ein neues 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue Durchstechflasche und übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette darauf.Um eine klarere Zelllösung zu erhalten, fügen Sie zunächst 15 Milliliter eines Dichtegradientenmediums zu einer neuen 50-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Gießen Sie die TMC-Lösung auf das Dichtegradientenmedium, wobei Sie darauf achten, das Mischen zu minimieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Beschleunigung und Abbremsen.Nachdem Sie die Durchstechflasche aus der Zentrifuge entfernt haben, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die obere Schicht zu entfernen und zu verwerfen. Stören Sie nicht die Schnittstelle zwischen den TMCs und dem Dichtegradientenmedium. Entfernen Sie dann die TMCs mit der sterilen Ein-Milliliter-Pipettespitze und geben Sie sie in eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche.Um die Zellen zu waschen, fügen Sie zuerst 50 Milliliter PBS mit 2% fetalem Rinderserum und 2 Millimolar EDTA hinzu. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen wieder, aber dieses Mal Zentrifuge das Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie R10 Kulturmedium durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktivierten FBS, 2 Millimolar L-Glutamin, und die Antibiotikum-Lösung. Setzen Sie die TMCs in 10 Milliliter R10 wieder aus. Zählen Sie dann die Zellen.Die Zellen können entweder sofort oder eingefroren für die zukünftige Verwendung verwendet werden, wie im Manuskript beschrieben. TMCs wurden mit Antikörpern befleckt, inkubiert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. TMCs enthielten alle wichtigen Immunzelltypen, die in peripheren mononukleären Zellen aus Blut, abgekürzt PMBC, vorhanden sind.Die Frequenzen aller Zelltypen, mit Ausnahme von B-Zellen, waren jedoch in TMCs niedriger als bei PBMCs. Um die Zellaktivierung in der Zytokinproduktion zu untersuchen, wurden TMCs über Nacht mit Resiquimod R848 stimuliert. TMCs, blau geplottet, produzierten alle getesteten Zytokine mit Ausnahme von IFN Lambda 2/3 und IL-8, obwohl die Produktion niedriger war als in PBMCs, grün dargestellt.Die Falterhöhungen im Vergleich der R848 Stimulation mit keiner Stimulation sind rot notiert. Gereinigte und isolierte TMCs, blaue und tonsillierte Gewebeblöcke, orange, wurden 24 Stunden lang mit dem Influenza-A-Virus IAV stimuliert. Die IFN-Produktion wurde in TMCs nachgewiesen, aber nicht im Überstand der Gewebeblöcke, was darauf hindeutet, dass Gewebeexate nicht das beste Modell für die Untersuchung der Zytokinsekretion und Zellaktivierung sind.Nach der Vorinkubation mit dem toxischen Medikament C1 und der Stimulation mit R848 wurden TMCs und PBMCs auf Ihre Lebensfähigkeit geprüft. TMCs waren empfindlicher gegenüber C1. Dies legt nahe, dass neue Medikamente in zukünftigen Behandlungen in Zellen aus Geweben getestet werden sollten, nicht nur an Zelllinien, PBMCs oder Gewebeexplantationen. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die TMCs wie PBMCs aus Vollblut zu verwenden und die gleichen zellulären Experimente durchzuführen, wie die Reinigung eines bestimmten Zelltyps, Zellkultur, Durchflusszytometrie oder Einfrieren.Isolierungen von TMCs ermöglichen es, in einem relevanten Modell die Immunantwort in sekundären Lymphorganen in Pathologien mit Schleimhautimmunität besser zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...