Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

העבודה הזאת נתמכת על ידי הסוכנות הלאומית למחקר הלאומי של הסוכנות למען הפרקליט המחוזי (J-P. ח) לניסויים ומלגת N.B. (AAP 2017 166). נ מאשר תמיכה של anrs עבור ההתחברות (aap 2016 1), הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית embo עבור ההתחברות (LT 834 2017), תוכנית מימון ההפעלה "באושטיין" של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Ulm (lsbn. 0147) ו הגרמני forschans544/1 1 gealllllllllllll

הדגימות לא נאספו במיוחד למטרות מחקר והמחקר אינו נחשב פולשני. עם זאת, איסוף השקדים האנושיים דורש אישור מוסרי של הרשויות הרלוונטיות המקומיות. במקרה שלנו, היא אושרה על ידי הגנת האגודה דה אישית (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). יתרה מזאת, הסכמה של כל מטופל או נציג משפטי מתבקשים להשיג נתונים אישיים של תורמים (למ...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

השקדים האנושיים מייצגים מודל אינטגרטיבי ופיזיולוגי ex vivo ללמוד תגובות החיסונית מולדת בממשק רירית, משום שהם לחקות את התפקיד של איבר הלימפה המשני. מעניין, הרכב הסלולר של TMCs דומה ל-PBMCs וכולל את כל אוכלוסיות התאים הגדולות, למרות שהאחוז שלהם יכול להיות שונה מ-PBMCs מדם (איור 1). אוכלו...

מחקרים על איברי האנוש מוגבלים בשל נגישות, כמו גם סיבות אתיות ברורות. עם זאת, הם חיוניים כדי להבין באופן מלא את המורכבות של הביולוגיה האנושית. תרבויות של תאים מבודדים (התרבויות הראשיות או קווי התא) הם מערכת סטנדרטית בלימודי התא בביולוגיה בשל זמינותם. בעוד תרביות תאים מבודדים אפשרו תגליות מצטיינים, השימוש קווי התא הגיע על בדיקה מקרוב יותר כי הם לא לחקות באופן מלא vivo ביולוגיה איברים. עם זאת, התרבות של תאים תלת מימדיים או explants רקמות הוא מורכב מאוד4,5,6. אכן, פיסת רקמה או איבר הוא הטרודוגני מאוד כי הרכב התא שלה שונה בהתאם לוקליזציה ברקמה. לפיכך, שימוש בקוביות רקמה דורש ניתוח של משכפל טכני וביולוגי רבים, המוביל לצורך של מספר רב של תורמים או חולים.
רירית הקשורים רקמות הלימפה (מאלט) דומים מבחינה מבנית לבלוטות הלימפה אבל יש פונקציות ייחודיות, כי התפקיד העיקרי שלהם היא להסדיר חסינות רירית7. בניגוד לבלוטות הלימפה, אשר ממוקמות בדרך כלל במרחק מסוים מן הרקמות, מאלט ממוקמים בדרך כלל מיד מתחת האפיתל של רקמת רירית. באופן היסטולוגית, הם מורכבים בעיקר של ריכוזים גבוהים של B ו-T תאים, אבל גם אנטיגן הצגת תאים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטים. מאלט מהווה כ 50% של רקמת הלימפה בגוף האדם. מאלט מחולקת לתשע קבוצות בהתאם למיקומם: גולט (בטן-), BALT (ברונזה-), NALT (אפי), CALT (לחפון), LALT (גרון), מלח (עור-), VALT (vulvo-), O-בירה (מאורגן), ו D-בירה (מתפזרת) O-מאלט מורכב בעיקר של השקדים של הטבעת הטונשית של וואלדאייר והוא מאלט הנגיש ביותר8,9. אכן, השקדים הממוקמים בoropharynx מהווים את המכשול העיקרי המגן על העיכול והדרכי הנשימה (פוטנציאל) פולשנית מיקרואורגניזמים10. בנוסף, השקדים מכוסים על ידי קשקש משובח שאינו keratinizing אפיתל, נתמך על ידי כמוסה של רקמת חיבור המכיל כלי דם, עצבים, ו lymphatics, מתן גישה קלה לתאים החיסוניים11,12. יתר על כן, ניתוח שקדים, הפעולה הכירורגית של הסרת השקדים, הוא הליך נפוץ ביצוע על ילדים לאחר נשימה שינה מחוסר סדר, הפיכת שקדים רקמות זמין בקלות13 בהגדרות פיסיולוגיים.
שקדים לאפשר את המחקר של תגובת התא החיסונית בפתווגיות מעורבים חסינות רירית. אכן, ב-hiv זיהום, כי השקדים מורכבים ריכוז גבוה של תאים חיסוניים, הם היעד העיקרי של שכפול נגיפי, אך גם לייצר כמות גדולה של ציטוקינים שאינם מזוהים במחזור14,15. במדינות קבועות, אוכלוסיות נדירות של תאים מולדים כמו נמצאים ברקמות רירית שונים, כולל השקדים, אבל הם למעשה נעדרים מדם.
לפיכך, תאים מונוליטיים משקדים (TMCs) הם מודל רלוונטי ומורכב יותר מאשר PBMCs והוא יכול לענות על שאלות עמוקות יותר. מצד שני, השימוש הרחבות רקמות יכול להיות מורכב ולא תמיד רלוונטי למחקרים חיסוניים מולדים. כך, הקמנו מודל לחקור הפעלה חיסונית רירית באמצעות tmcs16. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד יעיל של TMCs מן השקדים האנושיים הטריים. שיטה זו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים תוך שמירה על היושרה שלהם למחקרים vivo ex.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

לימוד תאים בודדים מרקמות הלימפה הקשורות רירית (מאלט) מאפשר הבנה של תגובת תאים חיסוניים בפתווגיות מעורבים חסינות רירית, כי הם יכולים לדגמן אינטראקציות מארח הפתוגן ברקמה. בעוד תאים מבודדים נגזר מרקמות היו המודל הראשון של תרבות התא, השימוש שלהם הוזנח כי רקמות יכול להיות קשה להשיג. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים המוננוציליים של האדם (tmcs) מפני השקדים האנושיים בריאים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית. בידוד של TMCs מן השקדים הוא מהיר, כי השקדים בקושי יש אפיתל כל התשואה עד מיליארדי כל סוגי התא החיסונית העיקריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של הייצור cy, באמצעות מספר טכניקות, כולל חיסוני, qPCR, מיקרוסקופ, זרימה cy, ועוד., בדומה לשימוש בתאים היקפיים ברורים (PBMCs) מהדם. יתרה מזאת, TMCs מראים רגישות גבוהה יותר לבדיקות סמים מאשר PBMCs, אשר צריך להיחשב עבור רעילות בעתיד. כך, התרבויות vivo tmcs לשעבר הם מודל רירית קלה ונגישה.

לראשונה אפיינו את הפרופיל החיסוני של תאים נוכח בתרבות וניתח את כמות TMCs. . בעזרת השקדים והטטוטונסות כפי שמוצג באיור 1, כל סוגי התא החיסונית העיקריים הקיימים pbmcs מהדם היו מייצגים tmcs מן השקדים. עם זאת, ב-TMCs התדירות של כל סוגי התאים, למעט תאים B, היו נמוכים מ-PBMCs....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים באופן ברור מבני אדם בריאים שעברו ניתוח שקדים ניתוחים חלקיים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

תאי מונונוקלאר שקדים רלוונטיים ומורכבים יותר מתאי דם, ובידודם מאפשר לחקור את תגובת תאי החיסון בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר. הטכניקה שהקמנו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים מרקמה ריר תוך שמירה על שלמותם למחקרי אקס ויוו. השיטה היא פשוטה למדי, אבל השקדים צריכים להיות מטופלים במהירות ובזהירות על מנת למקסם את התשואה.להעביר את רקמת השקדים האנושית למעבדה כמתואר בטקסט כתב היד. לאחר מכן, מניחים את מסננת התא על צלחת תרבות 150 על 25 מילימטר. מניחים את כל כלי הניתוח בצלחת אחרת כדי לשמור אותם סטריליים.כל הדגימות העיקריות שלך צריך להיות מטופל בזהירות כפי שהם לא היו מוסמכים בעבר עשוי להכיל סוכנים זיהומיות. ואז לשפוך את PBS מן הבקבוקון לתוך מסננת, כי זה יכיל כמה תאים כי יש יציאה השקדים. באמצעות מטלאים סטריליים, להעביר את השקדים מן הבקבוקון לתוך צלחת התרבות באמצעות מטלאים סטריליים.במידת הצורך, הוסף PBS נוסף כדי לטבול את הרשת. הניתוח ייקח בערך 45 דקות לכל שקדים. זה חיוני כי במהלך תקופה זו השקדים שקועים כדי להבטיח כדאיות טובה ותפוקת התא.הסר רקמה מדממת שרירן צרוב באמצעות ממטרות ואזמל. בעזרת האזמל והפינצטה המעוקלת, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בקוטר של פחות מחצי סנטימטר. חותכים את כל הרקמה, כך חתיכות קטנות ניתן לטבול בכל עת.מניחים כמה חתיכות של רקמה מסננת התא. מגרדים אותם לרשת עם עלה זכוכית עד שנותרה רק שכבה דקה מאוד של סטרומה לבנה. הסר ומחק את הסטרומה כדי למנוע סתימת הרשת.לאחר מכן השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לרשת ולגרד אותו בפעם האחרונה. לאחר מכן, השתמש פיגט 10 מיליליטר כדי להעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוקון סטרילי. לשטוף את הרשת ואת מסננת התא עם PBS פעם אחת, ולהעביר את PBS לבקבוקון גם.לפני שתמשיך לתת את ההשעיה התא לנוח על הספסל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים מסמר 70 מיקרומטר סטרילי על גבי בקבוקון חדש של 50 מיליליטר. מעבירים בעדינות את ההשעיה של התא אל המסמר עם פיפסה של 10 מיליליטר.אם המנזר סתום, השתמש בחלק האחורי של קצה פיפיאט סטרילי של מיליליטר כדי לגרד את התאים דרך המנזר. שנה את המסנב לעתים קרובות ככל הנדרש. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, השלך את העל-טבעי. להשעות מחדש את גלולה על ידי הקשה בעדינות על הבקבוקון, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 35 מיליליטר של PBS. כדי להשלים את השלב הראשון של בידוד התאים, מניחים מסמרון חדש של 70 מיקרומטר על גבי בקבוקון חדש ומעבירים אליו את מתלי התא עם פיפיאט של 10 מיליליטר.כדי להשיג פתרון תא ברור יותר, התחל בהוספת 15 מיליליטר של מדיום הדרגתי בצפיפות לבקבוקון חדש של 50 מיליליטר. יוצקים את פתרון TMC על גבי המדיום הדרגתי צפיפות, נזהר למזער את הערבוב. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 1000 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה ובלם כבוי.לאחר הסרת הבקבוקון מהצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להסיר ולהשליך את השכבה העליונה. אל תפריע לממשק בין ה- TMCs לבין מדיום מעבר הצבע של הצפיפות. לאחר מכן הסר את TMCs עם קצה פיפטה סטרילי אחד מיליליטר ולהעביר אותם לבקבוקון חדש 50 מיליליטר.כדי לשטוף את התאים, תחילה להוסיף 50 מיליליטר של PBS המכיל 2%סרום בקר עוברי ו 2 מילימולרי EDTA. ואז צנטריפוגה הצינור ב 250 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב, אבל הפעם צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הכן את מדיום תרבות R10 על ידי השלמת RPMI 1640 עם FBS מושבת בחום של 10%, 2 מילימולרים L-גלוטמין, ואת הפתרון האנטיביוטי. להשעות מחדש את TMCs ב 10 מיליליטר של R10. אז תספור את התאים.ניתן להשתמש בתאים באופן מיידי או להקפיא אותם לשימוש עתידי כמתואר בכתב היד. TMCs היו מוכתמים, דגירה עם נוגדנים, מאופיין באמצעות ציטומטריה זרימה. TMCs הכילו את כל סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים בתאים חד-גרעיניים היקפיים מדם, PMBC מקוצר.עם זאת, התדרים של כל סוגי התאים, למעט תאי B, היו נמוכים יותר ב- TMCs מאשר במחשבים אישיים. כדי לחקור את הפעלת התא בייצור ציטוקינים, TMCs היו מגורה בן לילה עם R848 resiquimod. TMCs, התווה בכחול, הפיק את כל הציטוקינים שנבדקו למעט IFN Lambda 2/3 ו IL-8, אם כי הייצור היה נמוך יותר מאשר PBMCs, התווה בירוק.עליות קיפול השוואת גירוי R848 ללא גירוי נרשמות באדום. גושי רקמה מטוהרים ומבודדים, כחולים ושקדים, כתומים, היו מגורים במשך 24 שעות עם שפעת A וירוס, IAV. ייצור IFN זוהה ב- TMCs אך לא ב- supernatant של גושי הרקמות המציין כי מתפוצצי רקמות אינם המודל הטוב ביותר לחקר הפרשת ציטוקינים והפעלת תאים.לאחר הדגירה מראש עם התרופה הרעילה C1 וגירוי עם R848, TMCs ו- PBMCs הומתו על הכדאיות. TMCs היו רגישים יותר ל- C1. זה מרמז כי תרופות חדשות בטיפולים עתידיים צריך להיבדק בתאים מרקמות, לא רק על קווי תאים, PBMCs, או מתפוצץ רקמות. הליך זה מאפשר לנו להשתמש TMCs כמו PBMCs מדם שלם ולבצע את אותם ניסויים הסלולר כגון טיהור של סוג תא מסוים, תרבות התא, ציטומטריה זרימה או הקפאה.בידודים של TMCs מאפשר לאפיין טוב יותר, במודל רלוונטי, את התגובה החיסונית באיברים לימפואידיים משניים בפתולוגיות הכוללות חסינות ריר.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...