Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) per gli esperimenti e la borsa di studio N.B. (AAP 2017 166). N.S. riconosce il sostegno dell'ANRS per la borsa di studio (AAP 2016 1), l'Organizzazione europea di biologia molecolare EMBO for Fellowship (LT 834 2017), il programma di finanziamento per le startup "Baustein" della Facoltà di Medicina dell'Università di Ulm (LSBN.0147) e la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1).

Gli esemplari non vengono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è considerato invasivo. Tuttavia, la raccolta delle tonsille umane richiede l'approvazione etica da parte delle autorità locali competenti. Nel nostro caso, è stato approvato dalla Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Inoltre, viene richiesto il consenso di ogni paziente o rappresentante legale per ottenere i dati personali dei donatori (ad esempio, sesso, età, storia di infezioni ent) che possono aiut...

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Le tonsille umane rappresentano un modello ex vivo integrativo e fisiologico per studiare le risposte immunitarie innate nell'interfaccia mucosale, perché imitano il ruolo di un organo linfoide secondario. È interessante notare che la composizione cellulare dei TMC è simile ai PMC e include tutte le principali popolazioni di cellule, anche se la loro percentuale può essere diversa dai PMC dal sangue (Figura 1). Ulteriori popolazioni possono anche essere trovate, come tutte le risposte im...

Gli studi sugli organi umani sono limitati a causa dell'accessibilità e di ovvie ragioni etiche. Tuttavia, sono essenziali per comprendere appieno la complessità della biologia umana. Le colture di cellule isolate (colture primarie o linee cellulari) sono un sistema standard negli studi di biologia cellulare a causa della loro disponibilità. Mentre le colture di cellule isolate hanno permesso scoperte eccezionali, l'uso di linee cellulari è venuto su un esame più attento perché non imitano completamente la biologia degli organi in vivo. Tuttavia, la coltura di cellule tridimensionali o espianti tissutali è altamente complessa4,5,6. Infatti, un pezzo di tessuto o organo è altamente eterogeneo perché la sua composizione cellulare differisce a seconda della localizzazione nel tessuto. Pertanto, l'utilizzo di blocchi di tessuto richiede l'analisi di molti repliche tecniche e biologiche, portando alla necessità di un gran numero di donatori o pazienti.
I tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) sono strutturalmente simili ai linfonodi ma hanno funzioni uniche, perché il loro ruolo principale è quello di regolare l'immunitàmucosale 7. A differenza dei linfonodi, che di solito si trovano ad una certa distanza dai tessuti, i MALT si trovano generalmente immediatamente sotto l'epitelio del tessuto mucosale. Istologicamente, sono composti principalmente da alte concentrazioni di cellule B e T, ma anche cellule che presentano antigene come macrofagi e cellule dendritiche. MALT costituiscono circa il 50% del tessuto linfoide nel corpo umano. I MALT sono suddivisi in nove gruppi a seconda della loro posizione: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizzato) e D-MALT (diffuso). L'O-MALT è composto principalmente dalle tonsille dell'anello tonsillare di Waldeyer ed è il MALT8,,9più accessibile. Infatti, le tonsille situate nell'oropharynx costituiscono la principale barriera che protegge le vie digerenti e respiratorie dai microrganismi invasivi10. Inoltre, le tonsille sono coperte da un sottile epitelio squamoso non-cheratinizzante, supportato da una capsula di tessuto connettivo contenente vasi sanguigni, nervi e linfatici, fornendo un facile accesso alle cellule immunitarie11,12. Inoltre, la tonsillectomia, l'atto chirurgico di rimozione delle tonsille, è una procedura comune eseguita sui bambini che hanno la respirazione disordinata di sonno, rendendo le tonsille un tessuto facilmente disponibile13 in contesti fisiologici.
Tonsils permettono lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l'immunità mucosale. Infatti, nell'infezione da HIV, perché le tonsille sono composte da un'alta concentrazione di cellule immunitarie, sono il bersaglio principale della replicazione virale ma producono anche una grande quantità di citochine che non vengono rilevate nella circolazione14,15. A stati costanti, popolazioni rare di cellule simili innate sono presenti in vari tessuti mucosali, comprese le tonsille, ma sono essenzialmente assenti dal sangue.
Pertanto, le cellule mononucleari provenienti da tonsille (TMC) sono un modello più rilevante e complesso dei PBMC e possono rispondere a domande più profonde. D'altra parte, l'uso di espianti tissutali può essere complesso e non sempre rilevante per studi immunitari innati. Così, abbiamo stabilito un modello per studiare l'attivazione immunitaria mucosale utilizzando TMC16. Qui, descriviamo un metodo per un isolamento efficiente dei TMC dalle tonsille umane fresche. Questo metodo consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie pur mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Lo studio di cellule isolate da tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) consente di comprendere la risposta delle cellule immunitarie nelle patologie che coinvolgono l'immunità mucosale, perché possono modellare le interazioni ospite-patogeno nel tessuto. Mentre le cellule isolate derivate dai tessuti sono state il primo modello di coltura cellulare, il loro uso è stato trascurato perché il tessuto può essere difficile da ottenere. Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsille (TMC) da tonsille umane sane per studiare le risposte immunitarie innate al momento dell'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali. L'isolamento dei TMC dalle tonsille è rapido, perché le tonsille hanno a malapena alcun epitelio e producono fino a miliardi di tutti i principali tipi di cellule immunitarie. Questo metodo consente di rilevare la produzione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui immunoassays, qPCR, microscopia, citometria di flusso, ecc., simili all'uso di cellule mononucleari periferiche (PBMC) dal sangue. Inoltre, i TMC mostrano una maggiore sensibilità ai test antidroga rispetto ai PMC, che devono essere considerati per i test di tossicità futuri. Pertanto, le colture ex vivo TMC sono un modello mucosale facile e accessibile.

Per prima cosa abbiamo caratterizzato il profilo immunitario delle cellule presenti nella coltura e analizzato la quantità di TMC. Abbiamo fenotipato i TMC da tonsille con citometria di flusso. Come mostrato nella Figura 1, tutti i principali tipi di cellule immunitarie presenti nei PBMC dal sangue erano rappresentati nei TMC da tonsille. Tuttavia, nei TMC la frequenza di tutti i tipi di cellule, ad eccezione delle cellule B, era inferiore a quella dei PBMC....

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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsillare da esseri umani sani sottoposti a tonsillectomia chirurgica parziale per studiare le risposte immunitarie innate dopo l'attivazione, imitando l'infezione virale nei tessuti mucosali.

Isolamento delle cellule mononucleari del Tonsillar per studiare le risposte immunitarie innate Ex Vivo in un tessuto linfoide mucosale umano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Le cellule mononucleari tonsillari sono più rilevanti e complesse delle cellule del sangue e il loro isolamento consente lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l'immunità mucosa. La tecnica che abbiamo stabilito consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie da un tessuto mucoso mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo. Il metodo è abbastanza semplice, ma le tonsille devono essere maneggiate rapidamente e con cura al fine di massimizzare la resa.Trasportare il tessuto tonsillare umano in laboratorio come descritto nel testo manoscritto. Quindi, posizionare il filtro cellulare su un piatto di coltura da 150 per 25 millimetri. Mettere tutti gli strumenti di dissezione in un altro piatto per mantenerli sterili.Tutti i tuoi campioni principali devono essere maneggiati con cura in quanto non sono stati precedentemente qualificati e possono contenere agenti infettivi. Quindi versare il PBS dal flaconcino in un colino, perché conterrà alcune cellule che hanno uscita le tonsille. Utilizzando forcep sterili, trasferire le tonsille dal flaconcino nel piatto di coltura usando forcep sterili.Se necessario, aggiungere più PBS per immergere la griglia. La dissezione richiederà circa 45 minuti per tonsille. È fondamentale che durante questo periodo le tonsille siano sommerse per garantire una buona vitalità e rese cellulari.Rimuovere il tessuto cauterizzato insanguinato e fibroso usando le forcep e un bisturi. Usando il bisturi e le pinzette curve, tagliare il tessuto in piccoli pezzi di meno di mezzo centimetro di diametro. Tagliare tutto il tessuto in modo che i piccoli pezzi possano essere immersi in ogni momento.Posizionare alcuni pezzi di tessuto nel filtro cellulare. Raschiali sulla griglia con un pestello di vetro fino a quando rimane solo uno strato molto sottile di stroma bianco. Rimuovere e scartare lo stroma per evitare di intasare la griglia.Quindi utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare sulla griglia e raschiarla un'ultima volta. Successivamente, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare in una fiala sterile. Lavare una volta la griglia e il filtro cellulare con PBS e trasferire anche il PBS al flaconcino.Prima di procedere lasciare riposare la sospensione cellulare sul banco per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare un setaccio sterile di 70 micrometri sopra una nuova fiala da 50 millilitri. Trasferire delicatamente la sospensione cellulare sul setaccio con una pipetta da 10 millilitri.Se il setaccio è intasato, utilizzare la parte posteriore di una punta sterile di pipetta da un millilitro per raschiare le cellule attraverso il setaccio. Cambiare il setaccio tutte le volte che è necessario. Centrifugare le cellule a 250 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet toccando delicatamente il flaconcino, quindi sospendere di nuovo le celle in 35 millilitri di PBS. Per completare la prima fase di isolamento cellulare, posizionare un nuovo setaccio di 70 micrometri sopra un nuovo flaconcino e trasferire la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 millilitri.Per ottenere una soluzione cellulare più chiara, iniziare aggiungendo 15 millilitri di un mezzo gradiente di densità a una nuova fiala da 50 millilitri. Versare la soluzione TMC sopra il mezzo gradiente di densità, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione. Quindi, centrifugare la soluzione a 1000 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente con accelerazione e freno spento.Dopo aver rimosso il flaconcino dalla centrifuga, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per rimuovere e scartare lo strato superiore. Non disturbare l'interfaccia tra i TMC e il mezzo gradiente di densità. Quindi rimuovere i CTMC con la punta sterile della pipetta da un millilitro e trasferirli in una nuova fiala da 50 millilitri.Per lavare le cellule, aggiungere prima 50 millilitri di PBS contenenti il 2% di siero bovino fetale e 2 EDTA millimolare. Quindi centrifugare il tubo a 250 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare di nuovo le cellule, ma questa volta centrifugare il tubo a 400 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Preparare il terreno di coltura R10 integrando RPMI 1640 con FBS inattivato dal calore al 10%, 2 l-glutammina millimolare e la soluzione antibiotica. Sospendere di nuovo i MTM in 10 millilitri di R10. Quindi conta le celle.Le cellule possono essere utilizzate immediatamente o congelate per un uso futuro come descritto nel manoscritto. I MTM sono stati macchiati, incubati con anticorpi e caratterizzati utilizzando citometria a flusso. I MTM contenevano tutti i principali tipi di cellule immunitarie presenti nelle cellule mononucleari periferiche dal sangue, abbreviato PMBC.Tuttavia, le frequenze di tutti i tipi di cellule, ad eccezione delle celle B, erano più basse nei MTC che nei PBPC. Per studiare l'attivazione cellulare nella produzione di citochine, i MTC sono stati stimolati durante la notte con resiquimod R848. I CTMC, tracciati in blu, producevano tutte le citochine testate ad eccezione di IFN Lambda 2/3 e IL-8, sebbene la produzione fosse inferiore a quella dei PBPC, tracciati in verde.La piega aumenta confrontando la stimolazione R848 con nessuna stimolazione si nota in rosso. I TMC purificati e isolati, i blocchi di tessuto blu e tonsillare, arancione, sono stati stimolati per 24 ore con il virus influenzale A, IAV. La produzione di IFN è stata rilevata nei TMC ma non nel supernatante dei blocchi tissutali indicando che le espianto tissutali non sono il modello migliore per lo studio della secrezione di citochine e dell'attivazione cellulare.Dopo la pre-incubazione con il farmaco tossico C1 e la stimolazione con R848, TMC e PBPC sono stati saggiati per la vitalità. I CTC erano più sensibili al C1. Ciò suggerisce che nuovi farmaci nei futuri trattamenti dovrebbero essere testati nelle cellule dei tessuti, non solo sulle linee cellulari, sui PBPC o sugli espianto tissutale. Questa procedura ci consente di utilizzare i MTMC come i PFC di sangue intero e di eseguire gli stessi esperimenti cellulari come la purificazione di uno specifico tipo di cellula, la coltura cellulare, la citometria del flusso o il congelamento.Gli isolamenti dei TMC consente di caratterizzare meglio, in un modello pertinente, la risposta immunitaria negli organi linfoidi secondari in patologie che coinvolgono l'immunità mucosa.

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Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Un saggio ex vivo per studiare Candida albicans Morphogenesi ifale nel tratto gastrointestinale

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...