Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
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この作品は、アジェンス・ナショナル・ド・ラ・レシェルシュ・シュル・ル・シダ・エ・レ・ヘパティテスANRS(J-P.H)実験およびN.B.フェローシップ(AAP 2017 166)。N.S.は、ANRSによるフェローシップ(AAP 2016 1)、欧州分子生物学機構EMBOフェローシップ(LT 834 2017)、ウルム大学医学部のスタートアップ資金調達プログラム「バウシュタイン」(LSBN.0147)、ドイツフォルシュングスゲマイナンシャフトDFG(SM 544/1)からの支援を認めています。

標本は研究目的のために特別に収集されておらず、研究は侵襲的とは見なされません。しかし、ヒト扁桃腺の収集には、地方自治体の倫理的承認が必要です。私たちの場合、それはコンティテ・ド・プロテクション・デ・ペルヌ(IDRCB /EUDRACT:2018A0135847)によって承認されました。さらに、各患者または法定代理人の同意は、実験結果を解釈するのに役立つドナーの個人データ(例えば、性別、年?...

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ヒト扁桃腺は、二次リンパ器官の役割を模倣するため、粘膜界面で自然免疫応答を研究するための統合的かつ生理的なex vivoモデルを表す。興味深いことに、TMCの細胞組成はPBMCに似ており、主要な細胞集団をすべて含んでいるが、その割合は血液からのPBMCとは異なる場合がある(図1)。すべての免疫応答は組織(粘膜または二次リンパ器官)で開始され、血液中ではなく、?...

人間の臓器に関する研究は、アクセシビリティだけでなく、明らかな倫理的理由のために制限されています。しかし、人間の生物学の複雑さを十分に理解するためには不可欠です。単離された細胞(一次培養または細胞株)の培養は、その利用可能性による細胞生物学研究における標準的なシステムである。単離された細胞培養は顕著な発見を可能にしたが、細胞株の使用は生体内器官生物学を完全に模倣していないため、より精査されている。しかしながら、三次元細胞または組織外植物の培養は、4、5、65,と非常に複雑である。実際、組織または器官の一部は、その細胞組成が組織の局在に応じて異なるため、非常に異種である。したがって、組織ブロックを使用するには、多くの技術的および生物学的複製の分析が必要であり、多数のドナーまたは患者の必要性につながります。
粘膜関連リンパ組織(MALT)は、構造的にはリンパ節に類似しているが、独特の機能を有するが、その主な役割は粘膜免疫を調節することであるため7。通常、組織からある程度の距離に位置するリンパ節とは異なり、MALTは一般的に粘膜組織の上皮のすぐ下に位置する。組織学的には、それらは主に高濃度のB細胞とT細胞で構成されているが、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞も含まれる。MALTは人体におけるリンパ組織の約50%を構成する。MALTは、GALT(腸-)、BALT(気管支-)、ナルト(鼻)、CALT(結膜)、LALT(喉頭-)、SALT(皮膚-)、VALT(vulvo-)、O-MALT(組織化)、D-MALT(拡散)の9つのグループに細分化される。O-MALTは、主にワルダイヤーの扁桃環の扁桃腺で構成され、最もアクセスしやすいMALT88、99です。実際、中咽頭に位置する扁桃腺は、(潜在的)侵襲性微生物10から消化管および気道を保護する主要な障壁を構成する。また、扁桃腺は、細かい層状扁平上皮非角化上皮で覆われ、血管、神経、およびリンパ管を含む結合組織のカプセルによって支持され、免疫細胞11、12,12への容易なアクセスを提供する。さらに、扁桃摘出術は、扁桃腺を除去する外科的行為であり、睡眠障害呼吸を有する小児に対して行われる一般的な処置であり、扁桃腺を生理学的な設定で容易に利用できる組織13にする。
扁桃腺は、粘膜免疫を伴う病理における免疫細胞応答の研究を可能にする。実際、HIV感染では、扁桃腺は高濃度の免疫細胞で構成されているため、それらはウイルス複製の主な標的であるが、また、循環14,15,15において検出されない大量のサイトカインを産生する。安定した状態では、先天性細胞のまれな集団は扁桃腺を含む様々な粘膜組織に存在するが、本質的に血液から存在しない。
したがって、扁桃腺(TMC)の単核細胞は、PBMCよりも関連性が高く複雑なモデルであり、より深い質問に答えることができます。一方、組織外植の使用は複雑であり、常に自然免疫研究に関連するとは限りません。そこで、TMCs16を用いて粘膜免疫活性化を研究する16モデルを確立した。ここでは、新鮮なヒト扁桃腺からTMCを効率的に分離する方法について述べています。この方法は、ex vivo研究のために完全性を保ちながら、多数の免疫細胞の回復を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

粘膜関連リンパ組織(MALT)から単離された細胞を研究することは、組織における宿主病原体相互作用をモデル化することができるため、粘膜免疫を含む病理における免疫細胞応答の理解を可能にする。組織由来の単離細胞は最初の細胞培養モデルであったが、組織を得るのが難しいため、その使用は無視されてきた。本プロトコルでは、健康なヒト扁桃腺から扁桃体単核細胞(TMC)を容易に処理し培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。扁桃腺は上皮をほとんど持たず、すべての主要な免疫細胞タイプの数十億まで生じるので、扁桃腺からのTMCの分離は速いです。この方法は、血液からの末梢単核細胞(PBMCs)の使用と同様に、免疫測定、qPCR、顕微鏡、フローサイトメトリーなどを含む複数の技術を用いてサイトカイン産生を検出することを可能にする。さらに、TMCは、将来の毒性アッセイのために考慮する必要があるPBMCよりも薬物検査に対する感度が高いことを示しています。したがって、ex vivo TMC培養は、簡単でアクセス可能な粘膜モデルです。

まず、培養中に存在する細胞の免疫プロファイルを特徴付け、TMCの量を分析した。扁桃腺からTMCをフローサイトメトリーでフェノタイプしました。図1に示すように、血液からPBMCに存在する主要な免疫細胞型はすべて扁桃腺由来のTMCで表した。しかし、TMCではB細胞を除くすべての細胞タイプの頻度は、PBMCよりも低かった。
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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

本プロトコルでは、部分的な外科的扁桃摘出術を受けた健康なヒトから扁桃体単核細胞を容易に処理および培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。

ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

扁桃体単核細胞は血液細胞よりも関連性が高く複雑であり、その単離は粘膜免疫を伴う病理における免疫細胞応答の研究を可能にする。我々が確立した技術は、ex vivo研究のためにその完全性を維持しながら、粘膜組織から多数の免疫細胞を回復することを可能にする。この方法は非常に簡単ですが、収量を最大化するためには、扁桃腺を迅速かつ注意して処理する必要があります。原稿テキストに記載されているように、ヒト扁桃組織を実験室に輸送する。次に、細胞ストレーナーを150 x 25ミリメートルの培養皿の上に置きます。すべての解剖器具を別の皿に入れて、無菌状態に保ちます。彼らは以前に資格を持っておらず、感染性物質が含まれている可能性があるため、すべての主な標本は注意して処理する必要があります。次に、扁桃腺を出した細胞が含まれるため、バイアルからストレーナーにPBSを注ぎます。滅菌鉗子を使用して、扁桃腺をバイアルから滅菌鉗子を使用して培養皿に移す。必要に応じて、さらにPBSを追加してグリッドを浸します。解剖は扁桃腺あたり約45分かかります。この間、扁桃腺は良好な生存率と細胞収量を確保するために水没することが重要です。鉗子およびメスを使用して、焼灼された血まみれおよび筋腫組織を除去する。メスと湾曲したピンセットを使用して、組織を直径の半分未満の小片に切ります。小片を常に浸すことができるように、すべての組織をカットします。細胞のストレーナーに組織のいくつかの部分を置きます.白い間質の非常に薄い層だけが残るまで、ガラスの害虫でグリッドにそれらを削ります。グリッドを詰まらせないように、ストロマを取り除いて捨てます。その後、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液をグリッドに移し、最後に1回削ります。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液を無菌バイアルに移す。グリッドと細胞ストレーナーをPBSで一度洗い、PBSをバイアルにも移します。進む前に、セルサスペンションを室温で5分間ベンチに置きます。新しい50ミリリットルのバイアルの上に無菌70マイクロメートルのふるいを置きます。10ミリリットルのピペットで細胞懸濁液をふるいにそっと移します。ふるいが詰まっている場合は、無菌1ミリリットルピペットチップの背面を使用して、ふるいを通して細胞を削ります。必要に応じてふるいを頻繁に変更します。250回gで細胞を摂氏4度で10分間遠心分離する。遠心後、上清を捨てる。バイアルを軽くたたいてペレットを再中断し、35ミリリットルのPBSで細胞を再中断する。細胞分離の第1段階を完了するには、新しいバイアルの上に新しい70マイクロメートルのふるいを置き、10ミリリットルのピペットでセルサスペンションをその上に移します。より明確な細胞溶液を得るために、新しい50ミリリットルのバイアルに15ミリリットルの密度勾配培地を加えることから始めます。TMC溶液を密度勾配媒体の上に注ぎ、混合を最小限に抑えるように注意してください。次に、加速度とブレーキをオフにして室温で30分間、溶液を1000倍gで遠心する。遠心分離機からバイアルを取り出した後、10ミリリットルのピペットを使用して上層を取り除き、廃棄します。TMC と密度勾配媒体の間のインターフェイスを妨げないでください。その後、無菌1ミリリットルピペットチップでTMCを取り出し、新しい50ミリリットルバイアルに移します。細胞を洗浄するには、まず、2%のウシ胎児血清および2ミリモルEDTAを含むPBSの50ミリリットルを加える。その後、チューブを摂氏4度で10分間250倍gで遠心分離します。もう一度細胞を洗いますが、今度はチューブを摂氏4度で10分間400倍にします。RPMI 1640を10%熱不活性化FBS、2ミリモルL-グルタミン、および抗生物質溶液で補ってR10培地を調製する。TMCを10ミリリットルのR10で再中断します。次に、セルをカウントします。これらの細胞は、原稿に記載されているように、即時に使用するか、または将来の使用のために凍結することができます。TMCを染色し、抗体でインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて特徴付けた。TMCは、血液から末梢単核細胞に存在する主要な免疫細胞型すべてを含んでいた、 PMBCを省略した。しかし、B細胞を除くすべての細胞タイプの周波数は、TMCではPBMCよりも低かった。サイトカイン産生における細胞活性化を研究するために、TMCはレジキモドR848で一晩刺激した。青色でプロットされたTMCは、IFN Lambda 2/3およびIL-8を除くすべてのサイトカインを生産したが、生産量はPBMCよりも低かったが、緑色でプロットされた。折り目はR848刺激を無刺激と比較して増加し、赤色で示される。精製および単離されたTMC、青色、および扁桃組織ブロック、オレンジ、インフルエンザAウイルス、IAVで24時間刺激した。IFN産生はTMCで検出されたが、組織外植物がサイトカイン分泌および細胞活性化の研究のための最良のモデルではないことを示す組織ブロックの上清ではなかった。有毒薬物C1とR848による刺激で前培養した後、TMCおよびPBMCは生存率についてアッセイされた。TMC は C1 に対してより敏感でした。これは、将来の治療法における新薬は、細胞株、PBMC、または組織外植物だけでなく、組織からの細胞でテストされるべきであることを示唆している。この手順により、全血からのPBMCのようなTMCを使用し、特定の細胞型の精製、細胞培養、フローサイトメトリーまたは凍結などの同じ細胞実験を行うことができます。TMCsの単離は、粘膜免疫を伴う病理における二次リンパ器官における免疫応答を、関連するモデルにおいてより良く特徴付けることを可能にする。

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HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

胃腸管における カンジダ・アルビカンス ・ヒphphal形態形成を研究するエクスビボアッセイ

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...