Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenter og N.B. fellesskap (AAP 2017 166). N.S. anerkjenner støtte fra ANRS for fellesskap (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), oppstartsfinansieringsprogrammet "Baustein" ved Det medisinske fakultet ved Ulm University (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Prøvene samles ikke spesielt inn for forskningsformål, og studien anses ikke som invasiv. Men human mandler samling krever etisk godkjenning av de lokale relevante myndigheter. I vårt tilfelle ble det godkjent av Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Videre bes samtykke fra hver pasient eller juridisk representant om å innhente giveres personopplysninger (f.eks. kjønn, alder, historie med ENT-infeksjoner) som kan bidra til å tolke eksperimentelle resultater.
1....

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Menneskelige mandler representerer en integrerende og fysiologisk ex vivo modell for å studere medfødte immunresponser ved slimhinnegrensesnittet, fordi de etterligner rollen som et sekundært lymfoid organ. Interessant, den cellulære sammensetningen av TMCs er lik PBMCs og inkluderer alle de store cellepopulasjonene, selv om deres prosentandel kan være forskjellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Ytterligere populasjoner kan også bli funnet, da alle immunresponser initieres i vev (slimhin...

Studier på menneskelige organer er begrenset på grunn av tilgjengelighet samt åpenbare etiske årsaker. Imidlertid er de avgjørende for å fullt ut forstå kompleksiteten i menneskelig biologi. Kulturer av isolerte celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologistudier på grunn av deres tilgjengelighet. Mens isolerte cellekulturer har tillatt fremragende funn, har bruken av cellelinjer kommet nærmere gransking fordi de ikke fullt ut etterligner in vivo organbiologi. Imidlertid er kulturen av tredimensjonale celler eller vevsekplanter svært komplekse4,5,6. Faktisk er et stykke vev eller organ svært heterogen fordi cellesammensetningen varierer avhengig av lokaliseringen i vevet. Dermed, ved hjelp av vev blokker krever analyse av mange tekniske og biologiske replikerer, noe som fører til behov for et stort antall donorer eller pasienter.
Slimhinne-assosiert lymfoid vev (MALT) er strukturelt lik lymfeknuter, men har unike funksjoner, fordi deres hovedrolle er å regulere slimhinne immunitet7. I motsetning til lymfeknuter, som vanligvis ligger i en viss avstand fra vevet, er MALT vanligvis plassert umiddelbart under epitelet i slimhinnevevet. Histologisk består de hovedsakelig av høye konsentrasjoner av B- og T-celler, men også antigen-presenterende celler som makrofager og dendrittiske celler. MALT utgjør ca 50% av lymfoidvevet i menneskekroppen. MALT er delt inn i ni grupper avhengig av deres plassering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strupehode-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisert) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsakelig av mandlene til Waldeyers tonsillarring og er den mest tilgjengelige MALT8,,9. Faktisk utgjør mandler som ligger i oropharynx den store barrieren som beskytter fordøyelses- og luftveiene mot (potensielle) invasive mikroorganismer10. I tillegg er mandlene dekket av en fin stratifisert plateepitel ikke-keratinizing epitel, støttet av en kapsel av bindevev som inneholder blodkar, nerver og lymfekreft, noe som gir enkel tilgang til immuncellene11,12. Videre er mandlene, den kirurgiske handlingen med å fjerne mandler, en vanlig prosedyre utført på barn som har søvnrelatert pust, noe som gjør mandlene til et lett tilgjengelig vev13 i fysiologiske omgivelser.
Mandler tillater studiet av immuncellerespons i patologier som involverer slimhinneimmunitet. Faktisk, i HIV-infeksjon, fordi mandlene består av en høy konsentrasjon av immunceller, er de hovedmålet for viral replikering, men produserer også en stor mengde cytokiner som ikke oppdages i sirkulasjonen14,15. Ved steady states er sjeldne populasjoner av medfødte celler tilstede i ulike slimhinnevev, inkludert mandlene, men er i hovedsak fraværende fra blod.
Mononukleære celler fra mandlene (TMCer) er dermed en mer relevant og kompleks modell enn PBMCs og kan svare på mer dyptgripende spørsmål. På den annen side kan bruken av vevsekplanter være komplisert og ikke alltid relevant for medfødte immunstudier. Dermed etablerte vi en modell for å studere slimhinne immunaktivering ved hjelp av TMCs16. Her beskriver vi en metode for effektiv isolering av TMCer fra friske menneskelige mandler. Denne metoden gjør det mulig å gjenopprette et stort antall immunceller samtidig som de holder sin integritet for ex vivo-studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Ved å studere isolerte celler fra slimhinne-assosiert lymfoidvev (MALT) kan forståelse av immuncellers respons i patologier som involverer slimhinneimmunitet, fordi de kan modellere vertspatogeninteraksjoner i vevet. Mens isolerte celler avledet fra vev var den første cellekulturmodellen, har bruken blitt neglisjert fordi vev kan være vanskelig å få tak i. I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler (TMCer) fra friske menneskelige mandler for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev. Isolering av TMCer fra mandlene er rask, fordi mandlene knapt har noe epitel og gir opp til milliarder av alle store immuncelletyper. Denne metoden tillater påvisning av cytokinproduksjon ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunanalyser, qPCR, mikroskopi, strømningscytometri, etc., lik bruk av perifere mononukleære celler (PBMCer) fra blod. Videre viser TMCs en høyere følsomhet for narkotikatesting enn PBMCs, som må vurderes for fremtidige toksisitetsanalyser. Dermed er ex vivo TMCs kulturer en enkel og tilgjengelig slimhinnemodell.

Vi karakteriserte først immunprofilen til celler som finnes i kulturen og analyserte mengden TMCer. Vi fenotypet TMCs fra mandler med strømningscytometri. Som vist i figur 1var alle store immuncelletyper til stede i PBMCer fra blod representert i TMCene fra mandler. I TMCer var imidlertid frekvensen av alle celletyper, unntatt B-celler, lavere enn i PBMCer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src=...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler fra friske mennesker som gjennomgår delvis kirurgisk mandlene for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev.

Isolering av tonsillar mononukleære celler for å studere ex vivo medfødte immunresponser i et humant slimhinnelymfoid vev

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsillar mononukleære celler er mer relevante og komplekse enn blodceller, og deres isolasjon tillater studiet av immuncellerespons i patologier som involverer slimhinneimmunitet. Teknikken vi har etablert tillater utvinning av et stort antall immunceller fra et slimhinnevev samtidig som de holder integriteten for ex vivo-studier. Metoden er ganske grei, men mandlene må håndteres raskt og med forsiktighet for å maksimere utbyttet.Transporter det menneskelige mandlene vev til laboratoriet som beskrevet i manuskriptteksten. Deretter plasserer du cellesilen på en 150 med 25 millimeter kulturrett. Legg alle disseksjonsinstrumentene i en annen tallerken for å holde dem sterile.Alle dine hovedprøver skal håndteres med forsiktighet, da de ikke tidligere har vært kvalifisert og kan inneholde smittsomme stoffer. Hell deretter PBS fra hetteglasset i en sil, fordi det vil inneholde noen celler som har egressed mandlene. Ved hjelp av sterile tang, overføre mandlene fra hetteglasset inn i kulturfatet ved hjelp av sterile tang.Legg eventuelt til mer PBS for å senke rutenettet. Disseksjonen vil ta ca 45 minutter per mandler. Det er avgjørende at mandlene i løpet av denne tiden er nedsenket for å sikre god levedyktighet og celleutbytter.Fjern cauterized blodig og fibroid vev ved hjelp av tang og en skalpell. Bruk skalpellen og de buede pinsettene, kutt vevet i små biter på mindre enn en halv centimeter i diameter. Klipp alt vevet slik at de små bitene kan nedsenkes til enhver tid.Legg noen biter av vev i cellesilen. Skrap dem på rutenettet med et glass pestle til bare et veldig tynt lag med hvit stroma gjenstår. Fjern og kast stroma for å unngå tilstopping av gitteret.Bruk deretter en 10-milliliter pipette til å overføre cellefjæringen til rutenettet og skrape den en siste gang. Deretter bruker du en 10-milliliter pipette til å overføre cellefjæringen til et sterilt hetteglass. Vask gitteret og cellesilen med PBS én gang, og overfør PBS til hetteglasset også.Før du fortsetter la cellefjæringen hvile på benken i fem minutter ved romtemperatur. Plasser en steril 70-mikrometer sil på toppen av et nytt 50-milliliter hetteglass. Overfør cellefjæringen forsiktig til silen med en 10-milliliter pipette.Hvis silen er tilstoppet, bruk baksiden av en steril en-milliliter pipettespiss til å skrape cellene gjennom silen. Bytt silen så ofte som nødvendig. Sentrifuger cellene ved 250 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Etter sentrifugering, kast supernatanten. Re-suspendere pellet ved å forsiktig tappe hetteglasset, og deretter re-suspendere cellene i 35 milliliter PBS. For å fullføre den første fasen av celleisolering, plasser en ny 70-mikrometer sil på toppen av et nytt hetteglass og overfør cellefjæringen på den med en 10-milliliter pipette.For å få en klarere celleløsning, begynn med å legge til 15 milliliter av et tetthetsgradientmedium til et nytt 50-milliliter hetteglass. Hell TMC-løsningen på toppen av tetthetsgradientmediet, vær forsiktig med å minimere blanding. Deretter sentrifuger oppløsningen ved 1000 ganger g i 30 minutter ved romtemperatur med akselerasjon og brems av.Når du har fjernet hetteglasset fra sentrifugen, bruk en 10-milliliter pipette til å fjerne og kaste det øvre laget. Ikke forstyrr grensesnittet mellom TMCene og tetthetsgradientmediet. Fjern deretter TMCene med den sterile en-milliliter pipettespissen og overfør dem til et nytt 50-milliliter hetteglass.For å vaske cellene, legg først til 50 milliliter PBS som inneholder 2% fosterbovinserum og 2 millimolar EDTA. Sentrifuger deretter røret ved 250 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Vask cellene igjen, men denne gangen sentrifuger røret på 400 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Forbered R10 kulturmedium ved å supplere RPMI 1640 med 10% varmeinaktivert FBS, 2 millimolar L-glutamin og antibiotikaløsningen. Re-suspendere TMCs i 10 milliliter på R10. Tell deretter cellene.Cellene kan enten brukes umiddelbart eller frosset til fremtidig bruk som beskrevet i manuskriptet. TMCs ble farget, inkubert med antistoffer, og karakterisert ved hjelp av strømningscytometri. TMCs inneholdt alle de viktigste immuncelletypene som finnes i perifere mononukleære celler fra blod, forkortet PMBC.Frekvensene for alle celletyper, unntatt B-celler, var imidlertid lavere i TMC-er enn i PBMCer. For å studere celleaktivering i cytokinproduksjon ble TMCer stimulert over natten med resiquimod R848. TMC-er, plottet i blått, produserte alle cytokinene som ble testet med unntak av IFN Lambda 2/3 og IL-8, selv om produksjonen var lavere enn i PBMCer, plottet i grønt.Folden øker sammenligne R848 stimulering til ingen stimulering er notert i rødt. Rensede og isolerte TMCer, blå og tonsillar vevblokker, oransje, ble stimulert i 24 timer med influensa A-virus, IAV. IFN-produksjonen ble oppdaget i TMCer, men ikke i supernatant av vevsblokkene som indikerer at vevsutvinninger ikke er den beste modellen for studiet av cytokinsekresjon og celleaktivering.Etter pre-inkubasjon med det giftige stoffet C1 og stimulering med R848 ble TMC og PBMCer analysert for levedyktighet. TMCer var mer følsomme for C1. Dette tyder på at nye legemidler i fremtidige behandlinger bør testes i celler fra vev, ikke bare på cellelinjer, PBMCer, eller vev explants. Denne prosedyren tillater oss å bruke TMCs som PBMCer fra fullblods og til å utføre de samme cellulære eksperimenter som rensing av en bestemt celletype, cellekultur, flytcytometri eller frysing.Isolasjoner av TMCer gjør det mulig å bedre karakterisere, i en relevant modell, immunresponsen i sekundære lymfoide organer i patologier som involverer slimhinneimmunitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av fettvev immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøvetaking slimhinnene slimhinnen væske for kvantifisering av In Vivo øvre luftveier immun-megler nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infeksjon av menneskelig lymfoid vev og Female Genital Mucosa humant immunsviktvirus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar i Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...