Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups "Baustein" da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).

Os espécimes não são coletados especificamente para fins de pesquisa e o estudo não é considerado invasivo. No entanto, a coleta de amígdalas humanas requer aprovação ética das autoridades locais relevantes. No nosso caso, foi aprovado pelo Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Além disso, solicita-se o consentimento de cada paciente ou representante legal para obter dados pessoais dos doadores (por exemplo, sexo, idade, histórico de infecções por ENT) que possam ajudar a interpr...

<ol>
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As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são inicia...

Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa4,,5,6. De fato, um pedaço de tecido ou órgão é altamente heterogênios porque sua composição celular difere dependendo da localização no tecido. Assim, o uso de blocos teciduais requer a análise de muitas réplicas técnicas e biológicas, levando à necessidade de um grande número de doadores ou pacientes.
Os tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) são estruturalmente semelhantes aos linfonodos, mas têm funções únicas, pois seu principal papel é regular a imunidade mucosa7. Ao contrário dos linfonodos, que geralmente estão localizados a alguma distância dos tecidos, o MALT geralmente está localizado imediatamente abaixo do epitélio do tecido mucosal. Histologicamente, eles são compostos principalmente de altas concentrações de células B e T, mas também células que apresentam antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Malt constituem cerca de 50% do tecido linfoide no corpo humano. Malt são subdivididos em nove grupos, dependendo de sua localização: GALT (intestino),BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntivista), LALT (laringe-), SALT (pele-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) e D-MALT (difundido). O O-MALT é composto principalmente pelas amígdalas do anel de amígdalas de Waldeyer e é o MALT8,,9. De fato, as amígdalas localizadas na orofaringe constituem a principal barreira que protege os tratos digestivos e respiratórios dos (potenciais) microrganismos invasivos10. Além disso, as amígdalas são cobertas por um epitélio escânio estratificado estratificado, apoiado por uma cápsula de tecido conjuntivo contendo vasos sanguíneos, nervos e linfáticos, proporcionando fácil acesso às células imunes11,,12. Além disso, a amigdaxia, o ato cirúrgico de remoção de amígdalas, é um procedimento comum realizado em crianças com respiração desordenada do sono, tornando as amígdalas um tecido facilmente disponível13 em ambientes fisiológicos.
As amígdalas permitem o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. De fato, na infecção pelo HIV, como as amígdalas são compostas por uma alta concentração de células imunes, elas são o principal alvo da replicação viral, mas também produzem uma grande quantidade de citocinas que não são detectadas na circulação14,15. Em estados estáveis, populações raras de células inatas estão presentes em vários tecidos mucosas, incluindo as amígdalas, mas estão essencialmente ausentes do sangue.
Assim, as células mononucleares de amígdalas (TMCs) são um modelo mais relevante e complexo do que os PBMCs e podem responder a perguntas mais profundas. Por outro lado, o uso de explants teciduais pode ser complexo e nem sempre relevante para estudos imunológicos inatas. Assim, estabelecemos um modelo para estudar a ativação imunológica mucosa utilizando TMCs16. Aqui, descrevemos um método para o isolamento eficiente dos TMCs de amígdalas humanas frescas. Este método permite a recuperação de um grande número de células imunes, mantendo sua integridade para estudos ex vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.

Primeiro caracterizamos o perfil imunológico das células presentes na cultura e analisamos a quantidade de TMCs. Nós fenítipamos os TMCs de amígdalas com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1,todos os principais tipos de células imunes presentes em PBMCs do sangue foram representadores nos TMCs das amígdalas. No entanto, nos TMCs a frequência de todos os tipos de células, exceto as células B, foram menores do que em PBMCs.
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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

As células mononucleares tonsilármais são mais relevantes e complexas do que as células sanguíneas, e seu isolamento permite o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. A técnica que estabelecemos permite a recuperação de um grande número de células imunes de um tecido mucosa, mantendo sua integridade para estudos ex vivo. O método é bastante simples, mas as amígdalas precisam ser tratadas rapidamente e com cuidado para maximizar o rendimento.Transporte o tecido amísil humano para o laboratório, conforme descrito no texto do manuscrito. Em seguida, coloque o coador de células em um prato de cultura de 150 por 25 milímetros. Coloque todos os instrumentos de dissecção em outro prato para mantê-los estéreis.Todos os seus principais espécimes devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos. Em seguida, despeje o PBS do frasco em um coador, porque ele conterá algumas células que egressaram as amígdalas. Usando fórceps estéreis, transfira as amígdalas do frasco para o prato de cultura usando fórceps estéreis.Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade. A dissecção levará cerca de 45 minutos por amígdala. É crucial que durante esse tempo as amígdalas estejam submersas para garantir uma boa viabilidade e rendimentos celulares.Remova tecido cauterizado sangrento e miomado usando fórceps e um bisturi. Usando o bisturi e a pinça curva, corte o tecido em pequenos pedaços de menos de meio centímetro de diâmetro. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular. Raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS uma vez, e transfira o PBS para o frasco também.Antes de prosseguir deixe a suspensão do celular descansar no banco por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque uma peneira estéril de 70 micrômetros em cima de um novo frasco de 50 mililitros. Transfira suavemente a suspensão da célula para a peneira com uma pipeta de 10 mililitros.Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta de um mililitro estéril para raspar as células através da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário. Centrifugar as células a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, descarte o supernasce. Suspenda novamente a pelota tocando suavemente o frasco e, em seguida, suspenda novamente as células em 35 mililitros de PBS. Para completar a primeira fase do isolamento celular, coloque uma nova peneira de 70 micrômetros em cima de um novo frasco e transfira a suspensão celular para ele com uma pipeta de 10 mililitros.Para obter uma solução celular mais clara, comece adicionando 15 mililitros de um gradiente de densidade ao novo frasco de 50 mililitros. Despeje a solução TMC em cima do meio de gradiente de densidade, tomando cuidado para minimizar a mistura. Em seguida, centrifufique a solução a 1000 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente com aceleração e freio desligado.Depois de remover o frasco da centrífuga, use uma pipeta de 10 mililitros para remover e descartar a camada superior. Não perturbe a interface entre os TMCs e o meio gradiente de densidade. Em seguida, remova os TMCs com a ponta de pipeta de um mililitro e transfira-os para um novo frasco de 50 mililitros.Para lavar as células, adicione primeiro 50 mililitros de PBS contendo soro bovino fetal de 2% e 2 milimilhas EDTA. Em seguida, centrifugar o tubo a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células novamente, mas desta vez centrifugar o tubo a 400 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Prepare o meio de cultura R10 suplementando o RPMI 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 milimônios L-glutamina e a solução antibiótica. Suspenda os TMCs em 10 mililitros de R10. Então conte as células.As células podem ser usadas imediatamente ou congeladas para uso futuro, conforme descrito no manuscrito. Os TMCs foram manchados, incubados com anticorpos e caracterizados por citometria de fluxo. Os TMCs continham todos os principais tipos de células imunes presentes em células mononucleares periféricas do sangue, abreviado PMBC.No entanto, as frequências de todos os tipos de células, exceto células B, foram menores em TMCs do que em PBMCs. Para estudar a ativação celular na produção de citocinas, os TMCs foram estimulados durante a noite com resiquimod R848. Os TMCs, plotados em azul, produziram todas as citocinas testadas, exceto ifn Lambda 2/3 e IL-8, embora a produção fosse menor do que em PBMCs, plotadas em verde.A dobra aumenta comparando a estimulação R848 com nenhuma estimulação é notada em vermelho. TMCs purificados e isolados, blocos de tecido azul e tonsilar, laranja, foram estimulados por 24 horas com o vírus influenza A, IAV. A produção de IFN foi detectada em TMCs, mas não no sobrenatante dos blocos teciduais indicando que as explantas teciduais não são o melhor modelo para o estudo da secreção de citocinas e ativação celular.Após a pré-incubação com a droga tóxica C1 e estimulação com R848, TMCs e PBMCs foram avaliados para viabilidade. Os TMCs eram mais sensíveis ao C1. Isso sugere que novas drogas em tratamentos futuros devem ser testadas em células a partir de tecidos, não apenas em linhas celulares, PBMCs ou explants teciduais. Este procedimento nos permite usar os TMCs como PBMCs de sangues inteiros e realizar os mesmos experimentos celulares, como purificação de um tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo ou congelamento.Isolamentos de TMCs possibilitam caracterizar melhor, em um modelo relevante, a resposta imune em órgãos linfoides secundários em patologias que envolvem imunidade mucosa.

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An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...