Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным агентством по де ла Рехерш-сюр-ле-СИДА и ле Хепатитов ANRS (J-P. H) для экспериментов и стипендий N.B. (AAP 2017 166). N.S. признает поддержку со стороны ANRS для стипендий (AAP 2016 1), Европейской организации молекулярной биологии EMBO для стипендий (LT 834 2017), программы финансирования стартапа "Baustein" Медицинского факультета Ульмского университета (LSBN.0147) и Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Образцы не собираются специально для исследовательских целей, и исследование не считается инвазивным. Однако сбор человеческих миндалин требует этического одобрения со стороны местных соответствующих органов. В нашем случае он был одобрен Комиссаром защиты персон (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). К?...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Человеческие миндалины представляют собой интегративную и физиологическую модель ex vivo для изучения врожденных иммунных реакций в мукосальном интерфейсе, потому что они имитируют роль вторичного лимфоидного органа. Интересно, что клеточный состав ТМК похож на ПБМК и включает в себя в?...

Исследования на человеческих органах ограничены из-за доступности, а также очевидных этических причин. Тем не менее, они имеют важное значение для полного понимания сложности человеческой биологии. Культуры изолированных клеток (первичные культуры или клеточные линии) являются стандартной системой в исследованиях клеточной биологии из-за их наличия. В то время как изолированные клеточные культуры позволили выдающиеся открытия, использование клеточных линий пришло на более пристальное внимание, потому что они не полностью имитируют биологию органов vivo. Тем не менее, культура трехмерных клеток или тканей explants является весьма сложным4,,5,6. Действительно, часть ткани или органа очень неоднородна, потому что его клеточный состав отличается в зависимости от локализации в ткани. Таким образом, использование тканевых блоков требует анализа многих технических и биологических репликаций, что приводит к необходимости большого числа доноров или пациентов.
Связанные с слизистой оболочкой лимфоидные ткани (MALT) структурно похожи на лимфатические узлы, но имеют уникальные функции, потому что их основная роль заключается в регулировании слизистого иммунитета7. В отличие от лимфатических узлов, которые обычно расположены на некотором расстоянии от тканей, MALT, как правило, расположены непосредственно под эпителием слизистой оболочки ткани. Гистологически, они в основном состоят из высоких концентраций В и Т-клеток, но и антиген-представляющих клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. MALT составляют около 50% лимфоидной ткани в организме человека. MALT подразделяются на девять групп в зависимости от их местонахождения: GALT (кишка-), BALT (бронхус-), NALT (носовой), CALT (конъюнктивальный), LALT (гортань-), SALT (кожа-), VALT (вульво-), O-MALT (организовано) и D-MALT (диффенд). O-MALT в основном состоит из миндалин тонзиллярного кольца Вальдейера и является наиболее доступным MALT8,9. Действительно, миндалины, расположенные в ротоглоте, являются основным барьером, защищающим пищеварительные и дыхательные пути от (потенциальных) инвазивных микроорганизмов10. Кроме того, миндалины покрыты тонкой стратифицированной плоскоклеточной некератинирующей эпителием, поддерживаемой капсулой соединительной ткани, содержащей кровеносные сосуды, нервы и лимфатические, обеспечивая легкий доступ к иммунным клеткам11,12. Кроме того, тонзиллектомия, хирургический акт удаления миндалин, является общей процедурой, выполняемой на детей, имеющих расстройство сна дыхание, что делает миндалины легко доступны ткани13 в физиологических условиях.
Миндалины позволяют изучать иммунный клеточный ответ при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом. Действительно, при ВИЧ-инфекции, поскольку миндалины состоят из высокой концентрации иммунных клеток, они являются основной мишенью репликации вируса, но также производят большое количество цитокинов, которые не обнаружены в циркуляции14,15. В устойчивых состояниях редкие популяции врожденных клеток присутствуют в различных слизистых тканях, включая миндалины, но по существу отсутствуют в крови.
Таким образом, моноядерные клетки из миндалин (ТМК) являются более актуальной и сложной моделью, чем ПБМТ, и могут отвечать на более глубокие вопросы. С другой стороны, использование тканей эксплантов может быть сложным и не всегда имеет отношение к врожденным иммунным исследованиям. Таким образом, мы создали модель для изучения слизистой иммунной активации с помощью TMCs16. Здесь мы описываем метод эффективной изоляции ТМК от свежих человеческих миндалин. Этот метод позволяет восстановить большое количество иммунных клеток, сохраняя при этом их целостность для ex vivo исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Изучение изолированных клеток из слизистой оболочки связанных лимфоидных тканей (MALT) позволяет понять иммунный ответ клеток в патологиях с участием слизистого иммунитета, потому что они могут моделировать принимающих патогенных взаимодействий в тканях. В то время как изолированные клетки, полученные из тканей, были первой моделью клеточной культуры, их использование было пренебречь, потому что ткани могут быть трудно получить. В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток (ТМК) из здоровых человеческих миндалин для изучения врожденных иммунных реакций при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях. Изоляция ТМК от миндалин происходит быстро, потому что миндалины едва имеют эпителия и дают до миллиардов всех основных типов иммунных клеток. Этот метод позволяет выявлять выработку цитокинов с использованием нескольких методов, в том числе иммуноанализа, кЗКР, микроскопии, цитометрии потока и т.д., подобно использованию периферических моноядерных клеток (ПМБК) из крови. Кроме того, ТМК показывают более высокую чувствительность к тестированию на наркотики, чем PBMCs, которые необходимо учитывать для будущих анализов токсичности. Таким образом, ex vivo TMCs культур легко и доступной слизистой модели.

Сначала мы охарактеризовали иммунный профиль клеток, присутствующих в культуре, и проанализировали количество ТМК. Мы фенотипировали ТМК из миндалин с цитометрией потока. Как показано на рисунке 1,все основные типы иммунных клеток, присутствующих в ПБ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток здоровых людей, проходящих частичную хирургическую тонзиллектомию, изучать врожденные иммунные реакции при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях.

Изоляция миндалевидных моноядерных клеток для изучения Ex Vivo Врожденные иммунные реакции в человеческой мукозальной лимфоидной ткани

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Моноядерные клетки тонзилляра более актуальны и сложны, чем клетки крови, и их изоляция позволяет изучать иммунный клеточный ответ при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом. Техника, которую мы установили, позволяет восстановить большое количество иммунных клеток из слизистой ткани, сохраняя при этом их целостность для исследований ex vivo. Метод довольно прост, но миндали должны быть обработаны быстро и с осторожностью, с тем чтобы максимизировать урожайность.Транспортировка человеческой тонзиллярной ткани в лабораторию, как описано в тексте рукописи. Затем поместите клеточный ситечко на блюдо культуры 150 на 25 миллиметров. Поместите все инструменты для вскрытия в другое блюдо, чтобы держать их стерильными.Все ваши основные образцы должны быть обработаны с осторожностью, поскольку они ранее не были квалифицированы и могут содержать инфекционные агенты. Затем вылейте PBS из флакона в ситечко, потому что он будет содержать некоторые клетки, которые регрессировали миндали. Используя стерильные типсы, перенесите миндали из флакона в культурную тарелку с помощью стерильных типсов.При необходимости добавьте больше PBS, чтобы погрузить сетку. Вскрытие займет около 45 минут на миндалин. Крайне важно, чтобы в течение этого времени миндалины погружались в воду, чтобы обеспечить хорошую жизнеспособность и урожайность клеток.Удалите прижигаемую кровавую и миомную ткань с помощью миппов и скальпеля. Используя скальпель и изогнутые пинцеты, разрежьте ткань на мелкие кусочки диаметром менее половины сантиметра. Вырезать все ткани так, что мелкие кусочки могут быть погружены в любой момент.Поместите несколько кусков ткани в клеточный ситечко. Очистите их на сетку со стеклянным пестиком, пока не останется только очень тонкий слой белой стромы. Удалите и отбросьте строму, чтобы избежать засорения сетки.Затем используйте 10-миллилитровую пипету для переноса подвески ячейки на сетку и соскребать ее в последний раз. Затем используйте 10-миллилитровую пипету для переноса клеточной подвески в стерильный флакон. Вымойте сетку и ситечко клетки с PBS один раз, и передать PBS на флакон также.Перед началом дайте подвеске клетки отдохнуть на скамейке в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите стерильное 70-микрометровое сито поверх нового 50-миллилитрового флакона. Аккуратно перенесите подвесную клетку на сито с 10-миллилитровой пипеткой.Если сито забито, используйте заднюю часть стерильной одноми миллилитровой наконечник пипетки, чтобы соскребать клетки через сито. Изменение сито так часто, как это необходимо. Центрифуга клетки при 250 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.После центрифугации отбросьте супернатант. Повторно приостановить гранулы, осторожно нажав флакон, а затем повторно приостановить клетки в 35 миллилитров PBS. Чтобы завершить первую фазу изоляции клеток, поместите новое 70-микрометровое сито поверх нового флакона и перенесите на него подвеску клетки с помощью 10-миллилитровой пипетки.Чтобы получить более четкий клеточный раствор, начните с добавления 15 миллилитров градиентной среды плотности к новому 50-миллилитровому флакону. Налейте решение TMC поверх среды градиента плотности, будьте осторожны, чтобы свести к минимуму смешивание. Далее центрифуга раствора при 1000 г в течение 30 минут при комнатной температуре с ускорением и торможением.После удаления флакона из центрифуги используйте 10-миллилитровую пипету для удаления и отбрасывания верхнего слоя. Не мешать интерфейсу между ТМК и градиентной средой плотности. Затем удалите ТМК стерильным одноми миллилитровым наконечником пипетки и перенесите их в новый 50-миллилитровый флакон.Для мытья клеток сначала добавьте 50 миллилитров PBS, содержащих 2%фетальную сыворотку крупного рогатого скота и 2 миллимолярные ЭДТА. Затем центрифуга трубки при 250 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Вымойте клетки снова, но на этот раз центрифуга трубки на 400 раз g в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.Подготовка R10 культуры среды, дополнив RPMI 1640 с 10% тепла инактивированных FBS, 2 миллимолялар L-глутамин, и антибиотик раствор. Повторно приостанавливать ТМК в 10 миллилитров R10. Тогда посчитайте клетки.Клетки могут быть использованы немедленно или заморожены для использования в будущем, как описано в рукописи. ТМК окрашивались, инкубировались антителами и характеризовались цитометрией потока. ТМК содержали все основные типы иммунных клеток, присутствующих в периферических моноядерных клетках крови, сокращенно PMBC.Однако частоты всех типов клеток, за исключением В-клеток, были ниже в ТМК, чем в ПКМК. Для изучения активации клеток в производстве цитокинов, ТМК стимулировались на ночь с resiquimod R848. ТМК, построенные синим цветом, производили все проверенные цитокины, за исключением IFN Lambda 2/3 и IL-8, хотя производство было ниже, чем в ПМК, построенных зеленым цветом.Складка увеличивается, сравнивая стимуляцию R848 с отсутствием стимуляции, отмеченной красным цветом. Очищенные и изолированные ТМК, блоки синей и тонзиллярной тканей, оранжевые, стимулировались в течение 24 часов вирусом гриппа А, IAV. Производство IFN было обнаружено в ТМК, но не в супернатанте тканевых блоков, указывающих на то, что экспланты тканей не являются лучшей моделью для изучения секреции цитокинов и активации клеток.После предварительной инкубации с токсичным препаратом С1 и стимуляции с R848, ТМК и ПКМК были анализированы на жизнеспособность. ТМК были более чувствительны к C1. Это говорит о том, что новые препараты в будущих методов лечения должны быть протестированы в клетках из тканей, а не только на клеточных линиях, ПКМК, или ткани explants. Эта процедура позволяет нам использовать ТМК, такие как ПМК из цельной крови, и проводить те же клеточные эксперименты, такие как очищение определенного типа клеток, культура клеток, цитометрия потока или замораживание.Изоляция ТМК позволяет лучше охарактеризовать в соответствующей модели иммунный ответ во вторичных лимфоидных органах при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Модель администрирования Galleria mellonella устные Innate иммунных реакций Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...