Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para los experimentos y la beca N.B. (AAP 2017 166). N.S. reconoce el apoyo de la ANRS para la beca (AAP 2016 1), la Organización Europea de Biología Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), el programa de financiación de startups "Baustein" de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (LSBN.0147) y el Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Los especímenes no se recogen específicamente con fines de investigación y el estudio no se considera invasivo. Sin embargo, la recolección de amígdalas humanas requiere la aprobación ética de las autoridades locales pertinentes. En nuestro caso, fue aprobado por el Comité de Protección de las Personas (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Además, se solicita el consentimiento de cada paciente o representante legal para obtener los datos personales de los donantes (por ejemplo, sexo, edad, antecedentes de infecciones ...

<ol>
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Las amígdalas humanas representan un modelo integrador y fisiológico ex vivo para estudiar las respuestas inmunitarias innatas en la interfaz mucosa, porque imitan el papel de un órgano linfoide secundario. Curiosamente, la composición celular de los TMC es similar a las PBMC e incluye todas las principales poblaciones celulares, aunque su porcentaje puede ser diferente de los PBMC de la sangre (Figura 1). También se pueden encontrar poblaciones adicionales, ya que todas las respuestas ...

Los estudios sobre órganos humanos están restringidos debido a la accesibilidad, así como razones éticas obvias. Sin embargo, son esenciales para comprender plenamente la complejidad de la biología humana. Los cultivos de células aisladas (cultivos primarios o líneas celulares) son un sistema estándar en los estudios de biología celular debido a su disponibilidad. Si bien los cultivos celulares aislados han permitido descubrimientos sobresalientes, el uso de líneas celulares se ha visto un mayor escrutinio porque no imitan completamente la biología de órganos in vivo. Sin embargo, el cultivo de células tridimensionales o explantes de tejidos es altamente complejo4,,5,,6. De hecho, un pedazo de tejido u órgano es altamente heterogéneo porque su composición celular difiere dependiendo de la localización en el tejido. Por lo tanto, el uso de bloques de tejido requiere el análisis de muchas réplicas técnicas y biológicas, lo que lleva a la necesidad de un gran número de donantes o pacientes.
Los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) son estructuralmente similares a los ganglios linfáticos pero tienen funciones únicas, porque su función principal es regular la inmunidad a la mucosa7. A diferencia de los ganglios linfáticos, que generalmente se encuentran a cierta distancia de los tejidos, el MALT generalmente se encuentra inmediatamente debajo del epitelio del tejido mucoso. Histológicamente, se componen principalmente de altas concentraciones de células B y T, pero también células que presentan antígenos como macrófagos y células dendríticas. MalT constituyen alrededor del 50% del tejido linfoide en el cuerpo humano. MALT se subdivide en nueve grupos dependiendo de su ubicación: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntival), LALT (laringe-), SALT (piel-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) y D-MALT (difuso). El O-MALT se compone principalmente de las amígdalas del anillo amigdal de Waldeyer y es el MALT8,,9. De hecho, las amígdalas ubicadas en la orofaringe constituyen la principal barrera que protege las vías digestivas y respiratorias de los microorganismos (potenciales) invasivos10. Además, las amígdalas están cubiertas por un epítelio escamoso estratificado fino no queratinizante, apoyado por una cápsula de tejido conectivo que contiene vasos sanguíneos, nervios y linfáticos, proporcionando un fácil acceso a las células inmunitarias11,12. Además, la amigdalectomía, el acto quirúrgico de extirpar amígdalas, es un procedimiento común realizado en niños con respiración desordenada del sueño, haciendo de las amígdalas un tejido fácilmente disponible13 en entornos fisiológicos.
Las amígdalas permiten el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. De hecho, en la infección por el VIH, debido a que las amígdalas se componen de una alta concentración de células inmunitarias, son el principal objetivo de replicación viral, pero también producen una gran cantidad de citoquinas que no se detectan en la circulación14,,15. En estados estables, poblaciones raras de células innatas están presentes en varios tejidos mucosos, incluyendo las amígdalas, pero están esencialmente ausentes de la sangre.
Por lo tanto, las células mononucleares de las amígdalas (TMC) son un modelo más relevante y complejo que los PBMC y pueden responder a preguntas más profundas. Por otro lado, el uso de tejidos explantes puede ser complejo y no siempre relevante para los estudios inmunes innatos. Así, establecimos un modelo para estudiar la activación inmune de la mucosa utilizando LOS TMC16. Aquí, describimos un método para el aislamiento eficiente de los TMC de las amígdalas humanas frescas. Este método permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias manteniendo su integridad para estudios ex vivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

El estudio de las células aisladas de los tejidos linfoide asociados a la mucosa (MALT) permite comprender la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa, ya que pueden modelar interacciones huésped-patógeno en el tejido. Mientras que las células aisladas derivadas de los tejidos fueron el primer modelo de cultivo celular, su uso se ha descuidado porque el tejido puede ser difícil de obtener. En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amiglares (TMC) a partir de amígdalas humanas sanas para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa. El aislamiento de los TMC de las amígdalas es rápido, porque las amígdalas apenas tienen epitelio y producen hasta miles de millones de todos los principales tipos de células inmunitarias. Este método permite la detección de la producción de citoquinas utilizando varias técnicas, incluyendo inmunoensayos, qPCR, microscopía, citometría de flujo, etc., similar al uso de células mononucleares periféricas (PBMC) de la sangre. Además, los TMC muestran una mayor sensibilidad a las pruebas de drogas que los PBMC, que deben ser considerados para futuros ensayos de toxicidad. Por lo tanto, las culturas de TMCs ex vivo son un modelo mucoso fácil y accesible.

Primero caracterizamos el perfil inmune de las células presentes en el cultivo y analizamos la cantidad de TMC. Hemos fenotipado los TMC de amígdalas con citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 1,todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en los PBMC a partir de sangre fueron representan en los TMC de las amígdalas. Sin embargo, en los TMC la frecuencia de todos los tipos de células, excepto las células B, era menor que en ...

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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Las células mononucleares tonículas son más relevantes y complejas que las células sanguíneas, y su aislamiento permite el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. La técnica que hemos establecido permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias de un tejido mumoso manteniendo su integridad para estudios ex vivos. El método es bastante sencillo, pero las amígdalas deben manejarse rápidamente y con cuidado para maximizar el rendimiento.Transportar el tejido amigdalar humano al laboratorio como se describe en el texto manuscrito. A continuación, coloque el colador celular en un plato de cultivo de 150 por 25 milímetros. Coloque todos los instrumentos de disección en otro plato para mantenerlos estériles.Todos sus especímenes principales deben ser manipulados con cuidado, ya que no han sido previamente calificados y pueden contener agentes infecciosos. A continuación, vierta el PBS del vial en un colador, ya que contendrá algunas células que han salidado las amígdalas. Usando fórceps estériles, transfiera las amígdalas del vial al plato de cultivo usando fórceps estériles.Si es necesario, agregue más PBS para sumergir la cuadrícula. La disección tomará unos 45 minutos por amígdala. Es crucial que durante este tiempo las amígdalas se sumerjan para garantizar una buena viabilidad y rendimiento celular.Retire el tejido sangriento y fibroma cauterizado usando fórceps y un bisturí. Usando el bisturí y las pinzas curvas, corta el tejido en pequeños trozos de menos de medio centímetro de diámetro. Corte todo el tejido para que las piezas pequeñas puedan sumergirse en todo momento.Coloque algunos trozos de tejido en el colador celular. Rasparlos en la rejilla con un pestillo de vidrio hasta que sólo quede una capa muy delgada de estroma blanco. Retire y deseche el estroma para evitar obstruir la rejilla.A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la suspensión celular a la rejilla y rasparla una última vez. A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la suspensión celular a un vial estéril. Lave la rejilla y el colador celular con PBS una vez, y transfiera el PBS al vial también.Antes de continuar, deje reposar la suspensión celular en el banco durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque un tamiz estéril de 70 micrómetros encima de un nuevo vial de 50 mililitros. Transfiera suavemente la suspensión celular al tamiz con una pipeta de 10 mililitros.Si el tamiz está obstruido, utilice la parte posterior de una punta de pipeta estéril de un mililitro para raspar las células a través del tamiz. Cambie el tamiz tantas veces como sea necesario. Centrifugar las células a 250 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet tocando suavemente el vial y luego vuelva a suspender las células en 35 mililitros de PBS. Para completar la primera fase de aislamiento celular, coloque un nuevo tamiz de 70 micrómetros en la parte superior de un vial nuevo y transfiera la suspensión celular en él con una pipeta de 10 mililitros.Para obtener una solución celular más clara, comience agregando 15 mililitros de un medio de gradiente de densidad a un nuevo vial de 50 mililitros. Vierta la solución TMC encima del medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de minimizar la mezcla. A continuación, centrifugar la solución a 1000 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente con aceleración y freno apagado.Después de retirar el vial de la centrífuga, utilice una pipeta de 10 mililitros para extraer y desechar la capa superior. No perturbe la interfaz entre los TMC y el medio de gradiente de densidad. A continuación, retire los TMC con la punta estéril de una pipeta de un mililitro y transfiéralas a un nuevo vial de 50 mililitros.Para lavar las células, primero agregue 50 mililitros de PBS que contengan 2%suero bovino fetal y 2 EDTA milimétricas. A continuación, centrifugar el tubo a 250 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células de nuevo, pero esta vez centrifugar el tubo a 400 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Preparar el medio de cultivo R10 complementando RPMI 1640 con 10%FBS inactivado por calor, 2 mililitros de L-glutamina y la solución antibiótica. Vuelva a suspender los TMC en 10 mililitros de R10. Luego cuenta las células.Las celdas se pueden utilizar inmediatamente o congelarse para su uso futuro como se describe en el manuscrito. Los TMC se tiñeron, se incubaron con anticuerpos y se caracterizaron mediante citometría de flujo. Los TMC contenían todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en las células mononucleares periféricas de la sangre, abreviado PMBC.Sin embargo, las frecuencias de todos los tipos de celda, excepto las células B, eran más bajas en los TMC que en los PBMC. Para estudiar la activación celular en la producción de citoquinas, los TMC se estimulan durante la noche con el resiquimod R848. Los TMC, trazados en azul, produjeron todas las citoquinas probadas excepto IFN Lambda 2/3 e IL-8, aunque la producción fue inferior a la de los PBMC, trazadas en verde.El pliegue aumenta comparando la estimulación R848 con ninguna estimulación se observan en rojo. Los TMC purificados y aislados, azules y tonsillares, de color naranja, se estimularon durante 24 horas con el virus de la gripe A, IAV. La producción de IFN se detectó en los TMC, pero no en el sobrenadante de los bloques tisulares, lo que indica que los explantes de tejidos no son el mejor modelo para el estudio de la secreción de citoquinas y la activación celular.Después de la pre-incubación con el fármaco tóxico C1 y la estimulación con R848, se ensayaron TMCs y PBMC para su viabilidad. Los TMC eran más sensibles al C1. Esto sugiere que los nuevos medicamentos en futuros tratamientos deben probarse en células de tejidos, no solo en líneas celulares, PBMC o plantas de tejidos. Este procedimiento nos permite utilizar los TMCs como LOS PBMC de sangres enteras y realizar los mismos experimentos celulares como la purificación de un tipo celular específico, el cultivo celular, la citometría de flujo o la congelación.Los aislamientos de los TMC permiten caracterizar mejor, en un modelo relevante, la respuesta inmunitaria en órganos linfoide secundarios en patologías que implican inmunidad a la mucosa.

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An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...