Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) för experiment och N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. bekräftar stöd från ANRS for fellowship (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), startup funding program "Baustein" vid medicinska fakulteten vid Ulm University (LSBN.0147) och Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (544/1 1).

Proverna samlas inte in specifikt för forskningsändamål och studien anses inte vara invasiv. Insamling av mänskliga tonsiller kräver dock etiskt godkännande av de lokala berörda myndigheterna. I vårt fall godkändes det av Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Dessutom uppmanas samtycke från varje patient eller juridiskt ombud att inhämta givares personuppgifter (t.ex. kön, ålder, historia av ENT-infektioner) som kan bidra till att tolka experimentella resultat.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

Mänskliga tonsiller representerar en integrativ och fysiologisk ex vivo modell för att studera medfödda immunsvar vid mucosal gränssnittet, eftersom de efterliknar rollen av en sekundär lymfoida organ. Intressant nog är den cellulära sammansättningen av TMCs liknar PBMCs och omfattar alla de stora cellpopulationerna, även om deras andel kan skilja sig från PBMCs från blod (figur 1). Ytterligare populationer kan också hittas, eftersom alla immunsvar initieras i vävnader (slemhinn...

Studier på mänskliga organ är begränsade på grund av tillgänglighet samt uppenbara etiska skäl. Men de är nödvändiga för att fullt ut förstå komplexiteten i mänsklig biologi. Kulturer av isolerade celler (primära kulturer eller cellinjer) är ett standardsystem i cellbiologistudier på grund av deras tillgänglighet. Medan isolerade cellkulturer har tillåtit enastående upptäckter, har användningen av cellinjer kommit på närmare granskning eftersom de inte helt efterlikna in vivo orgelbiologi. Emellertid, kulturen av tredimensionella celler eller vävnad explants är mycket komplex4,5,6. Faktum är att en bit vävnad eller organ är mycket heterogen eftersom dess cellsammansättning skiljer sig beroende på lokaliseringen i vävnaden. Således, med hjälp av vävnadsblock kräver analys av många tekniska och biologiska replikat, vilket leder till behovet av ett stort antal givare eller patienter.
De slemhinna-associerade lymfoida vävnader (MALT) är strukturellt liknar lymfkörtlarna men har unika funktioner, eftersom deras huvudsakliga roll är att reglera mucosal immunitet7. Till skillnad från lymfkörtlarna, som vanligtvis ligger på ett visst avstånd från vävnaderna, malt är i allmänhet ligger omedelbart under epitelet av slemhinna vävnad. Histologiskt består de huvudsakligen av höga koncentrationer av B- och T-celler, men också antigenpresenterande celler som makrofager och dendritiska celler. MALT utgör cirka 50% av lymfoid vävnad i människokroppen. MALT är indelade i nio grupper beroende på var de befinner sig: GALT (gut-), BALT (bronkerna-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (struphuvud-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiserad) och D-MALT (diffust). O-MALT består huvudsakligen av tonsillerna i Waldeyers tonsillring och är den mest tillgängliga MALT8,,9. Faktum är att tonsiller som ligger i svalget utgör den största barriären som skyddar mag- och luftvägarna från (potentiella) invasiva mikroorganismer10. Dessutom är tonsiller omfattas av en fin stratifierad skivepitelcancer icke-keratiniserande epitel, med stöd av en kapsel av bindväv som innehåller blodkärl, nerver och lymfatik, vilket ger enkel tillgång till immuncellerna11,12. Dessutom tonsillektomi, den kirurgiska handlingen att ta bort tonsiller, är ett vanligt förfarande som utförs på barn med sömn-störd andning, vilket gör tonsiller en lätt tillgänglig vävnad13 i fysiologiska inställningar.
Tonsiller tillåter studier av immuncellsvar i patologier som involverar mukosal immunitet. Faktum är att i HIV-infektion, eftersom tonsiller består av en hög koncentration av immunceller, de är det huvudsakliga målet för virusreplikation men också producera en stor mängd cytokiner som inte upptäcks i cirkulationen14,15. Vid steady states, sällsynta populationer av medfödda-liknande celler finns i olika slemhinnor vävnader, inklusive tonsiller, men är i huvudsak frånvarande från blod.
Mononukleära celler från tonsiller (TMCs) är alltså en mer relevant och komplex modell än PBMCs och kan svara på mer djupgående frågor. Å andra sidan kan användningen av vävnad explants vara komplex och inte alltid relevant för medfödda immunstudier. Således etablerade vi en modell för att studera mucosal immunaktivering med TMCs16. Här beskriver vi en metod för effektiv isolering av TMCs från färska mänskliga tonsiller. Denna metod möjliggör återvinning av ett stort antal immunceller samtidigt som deras integritet för ex vivo studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Att studera isolerade celler från slemhinnor-associerade lymfoida vävnader (MALT) gör det möjligt att förstå immunceller svar i patologier som involverar mukosal immunitet, eftersom de kan modellera värd-patogeninteraktioner i vävnaden. Medan isolerade celler som härrör från vävnader var den första cellkultur modell, deras användning har försummats eftersom vävnad kan vara svårt att få. I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler (TMCs) från friska mänskliga tonsiller att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader. Isolering av TMCs från tonsiller är snabb, eftersom tonsiller knappt har någon epitel och ger upp till miljarder av alla större immuncelltyper. Denna metod gör det möjligt att upptäcka cytokinproduktion med hjälp av flera tekniker, inklusive immunoassays, qPCR, mikroskopi, flödescytometri, etc., liknande användningen av perifera mononukleära celler (PBMCs) från blod. Dessutom visar TMCs en högre känslighet för drogtester än PBMCs, som måste beaktas för framtida toxicitetsanalyser. Således är ex vivo TMCs kulturer en enkel och tillgänglig slemhinnor modell.

Vi karakteriserade först immunprofilen för celler som finns i kulturen och analyserade mängden TMCs. Vi fenotypade TMCs från tonsiller med flöde cytometri. Som visas i figur 1var alla större immuncelltyper som finns i PBMCs från blod representerade i TMCs från tonsiller. I TMCs var dock frekvensen för alla celltyper, utom B-celler, lägre än i PBMCs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler från friska människor genomgår partiell kirurgiska tonsillektomi att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader.

Isolering av tonsiller mononukleära celler att studera Ex Vivo medfödda immunsvar i en mänsklig mukosal lymfoid vävnad

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsiller mononukleära celler är mer relevanta och komplexa än blodkroppar, och deras isolering möjliggör studiet av immuncellsvar i patologier som involverar mucosal immunitet. Tekniken vi har etablerat möjliggör återvinning av ett stort antal immunceller från en slemhinnan vävnad samtidigt som deras integritet för ex vivo studier. Metoden är ganska okomplicerad, men tonsillerna måste hanteras snabbt och varsamt för att maximera avkastningen.Transportera den mänskliga tonsillvävnaden till laboratoriet enligt beskrivningen i manuskripttexten. Placera sedan cellsilen på en 150 av 25 millimeters kulturrätt. Placera alla dissektion instrument i en annan maträtt för att hålla dem sterila.Alla dina huvudexemplar ska hanteras varsamt eftersom de inte varit tidigare kvalificerade och kan innehålla smittämnen. Häll sedan PBS från injektionsflaskan i en sil, eftersom det kommer att innehålla vissa celler som har trätt i halsmandlar. Använda sterila tärna, överföra tonsillerna från injektionsflaskan i odlingsfatet med hjälp av sterila tärna.Om det behövs, lägg till mer PBS för att sänka ned rutnätet. Dissektionen kommer att ta ca 45 minuter per tonsill. Det är avgörande att under denna tid tonsillerna är nedsänkt för att säkerställa god lönsamhet och cell avkastning.Ta bort kauteriserad blodig och fibroid vävnad med hjälp av tuten och en skalpell. Med hjälp av skalpellen och den böjda pincett, skär vävnaden i små bitar av mindre än en halv centimeter i diameter. Skär all vävnad så att de små bitarna kan sänkas ner hela tiden.Placera några bitar av vävnad i cellen silen. Skrapa dem på gallret med ett glas mortelstöt tills endast ett mycket tunt lager av vit stroma kvar. Ta bort och kasta stroma för att undvika igensättning av gallret.Använd sedan en 10-milliliter pipett för att överföra cellupphängningen på gallret och skrapa den en sista gång. Använd därefter en 10-milliliter pipet för att överföra cellupphängningen till en steril injektionsflaska. Tvätta gallret och cellsilen med PBS en gång, och överför PBS till injektionsflaskan också.Innan du fortsätter låt cellen suspensionen vila på bänken i fem minuter i rumstemperatur. Placera en steril 70-mikrometers sikt ovanpå en ny 50-milliliter injektionsflaska. För försiktigt cellupphängningen upp på sikten med en 10-milliliter pipett.Om silen är igensatt, använd baksidan av en steril en milliliter pipettspets för att skrapa cellerna genom sikten. Byt sikt så ofta det behövs. Centrifugera cellerna vid 250 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Efter centrifugeringen kasserar du supernatanten. Åter upphäva pelleten genom att försiktigt knacka på injektionsflaskan, och sedan åter upphäva cellerna i 35 milliliter PBS. För att slutföra den första fasen av cellisolering, placera en ny 70-mikrometer sikt ovanpå en ny injektionsflaska och överföra cellupphängningen på den med en 10-milliliter pipett.För att få en tydligare celllösning, börja med att lägga till 15 milliliter av en densitet gradient medium till en ny 50-milliliter injektionsflaska. Häll TMC lösningen ovanpå densitet gradient medium, var noga med att minimera blandning. Därefter centrifugera lösningen vid 1000 gånger g i 30 minuter vid rumstemperatur med acceleration och bromsa av.När du har tagit ut injektionsflaskan från centrifugen, använd en 10-milliliter pipet för att ta bort och kassera det övre lagret. Stör inte gränssnittet mellan TMC:erna och densitetsgradientmediet. Ta sedan ut TMC:erna med den sterila en milliliterpipetten och överför dem till en ny 50-milliliter injektionsflaska.För att tvätta cellerna, först lägga 50 milliliter PBS som innehåller 2%fetala nötkreatur serum och 2 millimolar EDTA. Sedan centrifugera röret på 250 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Tvätta cellerna igen, men denna gång centrifugera röret på 400 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Förbered R10 odlingsmedium genom att komplettera RPMI 1640 med 10%värme-inaktiverade FBS, 2 millimolar L-glutamin, och den antibiotiska lösningen. Åter upphäva TMCs i 10 milliliter av R10. Räkna sedan cellerna.Cellerna kan antingen användas omedelbart eller frysas för framtida bruk enligt beskrivningen i manuskriptet. TMCs var färgas, inkuberas med antikroppar och kännetecknas med hjälp av flödescytometri. TC innehöll alla de stora immun celltyper som finns i perifera mononuclear celler från blod, förkortade PMBC.Frekvenserna för alla celltyper, utom B-celler, var dock lägre i TMCs än i PBMCs. För att studera cellaktivering i cytokinproduktionen stimulerades TMCs över natten med resiquimod R848. TC, ritas i blått, producerade alla cytokiner testas utom IFN Lambda 2/3 och IL-8, även om produktionen var lägre än i PBMCs, plottade i grönt.Vecket ökar jämföra R848 stimulering till ingen stimulering noteras i rött. Renat och isolerat TMCs, blå, och tonsiller vävnad block, orange, stimulerades för 24 timmar med influensa A-virus, IAV. IFN produktionen upptäcktes i TMCs men inte i supernatant av vävnad block som anger att vävnad explants inte är den bästa modellen för studier av cytokinsekretion och cellaktivering.Efter förinkubation med det giftiga läkemedlet C1 och stimulering med R848, var TMCs och PBMCs assayed för lönsamhet. TMCs var mer känsliga för C1. Detta tyder på att nya läkemedel i framtida behandlingar bör testas i celler från vävnader, inte bara på cellinjer, PBMCs, eller vävnad explants. Detta förfarande tillåter oss att använda TMCs som PBMCs från helblod och att utföra samma cellulära experiment såsom rening av en specifik celltyp, cellodling, flödescytometri eller frysning.Isoleringar av TMCs gör det möjligt att bättre karakterisera, i en relevant modell, immunsvaret i sekundära lymfoida organ i patologier som involverar mucosal immunitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion av mänskliga lymfoida vävnad och kvinnliga genitala slemhinnan med humant immunbristvirus 1 och Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo-analys att studera Candida albicans Hyphal Morphogenesis i mag-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...