Name: isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Bu çalışma Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P) tarafından desteklendi. H) deneyler ve N.B. bursu için (AAP 2017 166). N.S., ANRS'den burs (AAP 2016 1), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü EMBO for Fellowship (LT 834 2017), Ulm Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıp Fakültesi 'Baustein" ve Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1 1) için ANRS'den destek kabul eder.

Örnekler özellikle araştırma amacıyla toplanmaz ve çalışma invaziv olarak kabul edilmez. Ancak, insan bademcikleri toplama yerel ilgili makamlar tarafından etik onayı gerektirir. Bizim durumumuzda Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, her hastanın veya yasal temsilcinin rızası, deneysel sonuçların yorumlanmasına yardımcı olabilecek bağışçıların kişisel verilerini (örn. cinsiyet, yaş, KT enfeksiyonlarının öyküsü) elde etmek ...

<ol>
	<li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+History+of+Cell+Culture.">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital:+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line.">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture.">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection.">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture.">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).</li><li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).</li><li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants.">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li><li>Bachert, C., M&#246;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Tonsille+als+MALT+(mucosa-associated+lymphoid+tissue)+der+Nasenschleimhaut.">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li><li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+the+tonsils.">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li><li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance.">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Structure,+Function,+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue.">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li><li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children:+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT.">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li><li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL/DR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients.">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li><li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment.">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).</li><li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity.">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).</li><li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li><li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-1+,+BDCA-2++and+BDCA-3++dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua.">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li><li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood:+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing.">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li></ol>

İnsan bademcikleri mukozal arayüzde doğuştan gelen immün yanıtları incelemek için bütünleştirici ve fizyolojik ex vivo modeli temsil eder, çünkü ikincil lenfoid organın rolünü taklit ederler. İlginçtir ki, TMCs hücresel bileşimi PBMCs benzer ve tüm büyük hücre popülasyonları içerir, onların yüzdesi kandan PBMCs farklı olabilir rağmen(Şekil 1). Ek popülasyonlar da bulunabilir, tüm bağışıklık yanıtları dokularda başlatılır gibi (mukoza veya sekonder...

İnsan organları üzerinde yapılan çalışmalar erişilebilirliğin yanı sıra bariz etik nedenlerle de kısıtlanmıştır. Ancak, insan biyolojisinin karmaşıklığını tam olarak anlamak için gereklidirler. İzole hücrelerin kültürleri (birincil kültürler veya hücre çizgileri) hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılabilirlikleri nedeniyle standart bir sistemdir. İzole hücre kültürleri olağanüstü keşifler izin vermiş olsa da, onlar tam in vivo organ biyolojisi taklit etmez çünkü hücre hatlarının kullanımı daha yakından inceleme üzerine geldi. Ancak, üç boyutlu hücre veya doku eksbitki kültürü son derece karmaşık4,5,6. Gerçekten de, doku veya organ parçası son derece heterojendir çünkü hücre bileşimi dokudaki lokalizasyona bağlı olarak farklılık gösterir. Böylece, doku blokları kullanarak birçok teknik ve biyolojik çoğaltmalar analizi gerektirir, donör veya hastaların çok sayıda ihtiyaç yol açan.
Mukoza ile ilişkili lenfoid dokular (MALT) yapısal lenf düğümleri benzer ama benzersiz işlevleri var, ana rolü mukozal bağışıklık düzenlemek için çünkü7. Genellikle dokulardan bazı mesafelerde bulunan lenf düğümleri aksine, MALT genellikle mukozal doku epitel hemen altında yer almaktadır. Histolojik olarak, çoğunlukla B ve T hücrelerinin yüksek konsantrasyonlarda oluşur, ama aynı zamanda makrofajlar ve dendritik hücreler gibi antijen sunan hücreler. MALT insan vücudundaki lenfoid dokunun yaklaşık% 50'sini oluşturmaktadır. MALT konumlarına bağlı olarak dokuz gruba ayrılır: GALT (gut-), BALT (bronş-), NALT (nazal-), CALT (konjonktiva), LALT (gırtlak-), SALT (cilt-), VALT (vulvo-), O-MALT (organize) ve D-MALT (diffüz). O-MALT esas olarak Waldeyer bademcikhalka bademcikoluşur ve en erişilebilir MALT8,9. Nitekim, orofarenks bulunan bademcikler (potansiyel) invaziv mikroorganizmalar10 sindirim ve solunum10yollarını koruyan önemli bir bariyer oluşturmaktadır. Buna ek olarak, bademcikler ince tabakalı skuamöz olmayan keratinizing epitel ile kaplıdır, kan damarları içeren bağ dokusu bir kapsül tarafından desteklenen, sinirler, ve lenfatikler, bağışıklık hücrelerine kolay erişim sağlayan11,12. Ayrıca bademciklerin giderilmesinde yapılan cerrahi işlem olan tonsillektomi, uyku bozukluğu olan çocuklarda yapılan ve bademciklerin fizyolojik ortamlarda kolayca bulunabilen doku13'ü haline getiren yaygın bir işlemdir.
Bademcikler mukozal bağışıklık içeren patolojilerde immün hücre yanıtının incelenmesine olanak sağlar. Gerçekten de, HIV enfeksiyonu, bademcikler bağışıklık hücrelerinin yüksek konsantrasyonoluşur çünkü, onlar viral çoğaltma ana hedefi ama aynı zamanda dolaşımda tespit edilmez sitokinler büyük miktarda üretmek14,15. Sabit hallerde, doğuştan benzeri hücrelerin nadir popülasyonları bademcikler de dahil olmak üzere çeşitli mukozal dokularda mevcuttur, ancak aslında kan yok.
Bu nedenle bademciklerden (TMC) gelen mononükleer hücreler PBMC'lere göre daha alakalı ve karmaşık bir modeldir ve daha derin sorulara cevap verebilir. Öte yandan, doku eksbitkilerinin kullanımı karmaşık olabilir ve her zaman doğuştan gelen bağışıklık çalışmaları ile ilgili değildir. Böylece, TMCs16kullanarak mukozal immün aktivasyon çalışması için bir model oluşturdu. Burada TMC'lerin taze insan bademciklerinden verimli bir şekilde izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ex vivo çalışmalar için bütünlüğünü koruyarak bağışıklık hücrelerinin çok sayıda kurtarma sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 meshes steel grid - 1910 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198586</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 meshes steel grid - 230 &#181;m</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198591</td>
			<td>To put in the cell strainer Cellector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m white ClearLine cell strainers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>141379C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anios Excell D detergent</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>59852</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution, 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL Penicilium and 100 &#956;g/mL Streptomycin - to add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes Falcon 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>711200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Measures the luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence labeles antibodies</td>
			<td>See Table 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>198599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Use at 20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740390</td>
			<td>Bead-based immunoassay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7801</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Slow freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiquimod (R848)</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-r848</td>
			<td>TLR7/8 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>330009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade sterile N&#176;23</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>132523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>01-2222-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>To make wash buffer in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tonsillar mononuclear cells to study ex vivo innate immune responses in a human mucosal lymphoid tissue

Mukoza ile ilişkili lenfoid dokulardan izole hücrelerin incelenmesi (MALT) mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde bağışıklık hücrelerinin yanıtının anlaşılmasını sağlar, çünkü dokudaki konak-patojen etkileşimleri modelleyebilirler. Dokulardan elde edilen izole hücreler ilk hücre kültürü modeli iken, doku elde etmek zor olabilir, çünkü bunların kullanımı ihmal edilmiştir. Bu protokolde, sağlıklı insan bademciklerinden bademcikteknükleer hücrelerinin (TMC) aktivasyon üzerine doğuştan gelen immün yanıtları incelemek ve mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebildiğini açıklıyoruz. Bademciklerden TMC'lerin izolasyonu hızlıdır, çünkü bademciklerde ancak epitel vardır ve milyarlarca büyük bağışıklık hücresi tipine kadar verim verir. Bu yöntem, kandan periferik mononükleer hücrelerin (PBMCs) kullanımına benzer immünoassays, qPCR, mikroskopi, akış sitometrisi, vb. gibi çeşitli teknikler kullanılarak sitokin üretiminin saptanmasını sağlar. Ayrıca, TMC'ler uyuşturucu testine, gelecekteki toksisite testleri için dikkate alınması gereken PBMC'lere göre daha yüksek bir duyarlılık göstermektedir. Böylece ex vivo TMC kültürleri kolay ve erişilebilir bir mukozal modeldir.

İlk olarak kültürde bulunan hücrelerin bağışıklık profilini karakterize ettik ve TMC miktarını analiz ettik. TMC'leri bademciklerden akış sitometrisi ile fenotiple ettik. Şekil 1'degösterildiği gibi, Kandan Gelen PBMCs mevcut tüm büyük bağışıklık hücresi tipleri bademcikler TMCs temsil edildi. Ancak, TMCs b hücreleri hariç tüm hücre türlerinin sıklığı, PBMCs daha düşüktü.
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue at JoVE.com

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Bu protokolde, kısmi cerrahi tonsillektomi uygulanan sağlıklı insanlardan bademcikler mononükleer hücrelerin invazyon asyonunu inceleyip mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebileceğimizi açıklıyoruz.

Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Bademcikler mononükleer hücreler kan hücrelerinden daha alakalı ve karmaşıktır ve izolasyonları mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde bağışıklık hücresi yanıtının incelenmesine olanak sağlar. Kurduğumuz teknik, çok sayıda bağışıklık hücresinin bir mukozal dokudan kurtarılmasını sağlarken, ekstrem itimatçalışmaları için bütünlüklerini korumasını sağlar. Yöntem oldukça basittir, ancak bademcikler verimi en üst düzeye çıkarmak için hızlı ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.El yazması metinde açıklandığı gibi insan bademcik dokusunu laboratuvara taşıyın. Daha sonra, hücre süzgeci bir 150 tarafından 25 milimetrelik kültür çanak üzerine yerleştirin. Onları steril tutmak için başka bir çanak tüm diseksiyon aletleri yerleştirin.Tüm ana numuneleriniz daha önce kalifiye olmadıkları ve bulaşıcı ajanlar içermedikleri için özenle ele alınmalıdır. Sonra bir süzgeç içine şişeden PBS dökün, bademcikler çıkış var bazı hücreler içerecektir çünkü. Steril forceps kullanarak, steril forceps kullanarak kültür çanak içine şişe bademcikler aktarın.Gerekirse, ızgarayı batırmak için daha fazla PBS ekleyin. Diseksiyonu bademcik başına yaklaşık 45 dakika sürer. Bu süre zarfında bademciklerin iyi canlılık ve hücre verimi sağlamak için batık olması çok önemlidir.Forceps ve neşter kullanarak kürterize kanlı ve fibroid doku çıkarın. Neşter ve kavisli cımbız kullanarak, çapı yarım santimetreden daha az küçük parçalar halinde doku kesti. Küçük parçalar her zaman batırılmış olabilir, böylece tüm doku kesin.Hücre süzgecine birkaç parça doku yerleştirin. Beyaz stroma sadece çok ince bir tabaka kalana kadar bir cam haşere ile ızgara üzerine kazıyın. Izgarayı tıkamamak için stroma'yı çıkarın ve atın.Daha sonra hücre süspansiyonuna ızgaraya aktarmak ve son bir kez kazımak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna steril bir şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Izgarayı ve hücre süzgecini pbs ile bir kez yıkayın ve PBS'yi de şişeye aktarın.Devam etmeden önce hücre süspansiyon oda sıcaklığında beş dakika boyunca bankta dinlenmeye bırakın. Yeni bir 50 mililitrelik şişe üstüne steril 70 mikrometre elek yerleştirin. Hücre süspansiyonuna 10 mililitrelik pipetle yavaşça elek aktarın.Elek tıkanmışsa, hücreleri elekten kazımak için steril bir mililitrelik pipet ucunun arkasını kullanın. Elek gerektiği sıklıkta değiştirin. Hücreleri 250 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Santrifüjden sonra, supernatant atın. Şişeye hafifçe dokunarak peleti yeniden askıya alın ve 35 mililitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre izolasyonunun ilk aşamasını tamamlamak için, yeni bir şişenin üzerine 70 mikrometrelik yeni bir elek yerleştirin ve hücre süspansiyonuna 10 mililitrelik pipetle aktarın.Daha net bir hücre çözeltisi elde etmek için, yeni bir 50 mililitrelik şişeye 15 mililitre yoğunluk degradeli ortam ekleyerek başlayın. Karıştırmayı en aza indirmek için dikkatli olmak için, yoğunluk gradyan ortamın üstüne TMC çözeltisi dökün. Daha sonra, hızlanma ve fren kapalı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1000 kez g çözeltisantrik.Santrifüjden şişeyi çıkardıktan sonra, üst katmanı çıkarmak ve atmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. TMC'ler ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimi rahatsız etmeyin. Daha sonra steril bir mililitrelik pipet ucu ile TMC'leri çıkarın ve 50 mililitrelik yeni bir şişeye aktarın.Hücreleri yıkamak için, ilk% 2 fetal sığır serum ve 2 milimolar EDTA içeren PBS 50 mililitre ekleyin. Sonra tüpü 250 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Hücreleri tekrar yıkayın, ama bu sefer 400 kez g dört santigrat derece 10 dakika boyunca tüp santrifüj.RPMI 1640'ı %10 ısı yalıtımlı FBS, 2 milimolar L-glutamin ve antibiyotik çözeltisi ile tamamlayarak R10 kültür ortamını hazırlayın. TMC'leri 10 mililitre R10'da yeniden askıya alın. O zaman hücreleri say.Hücreler ya hemen kullanılabilir ya da makalede açıklandığı gibi gelecekteki kullanım için dondurulmuş. TMC'ler boyandı, antikorlarla kuluçkaya yatırıldı ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. TMC'ler kandan periferik mononükleer hücrelerde bulunan tüm majör immün hücre tiplerini içeriyordu, kısaltılmış PMBC.Ancak, B hücreleri hariç tüm hücre türlerinin frekansları TBMC'lerde KİT'lere göre daha düşüktü. Sitokin üretiminde hücre aktivasyonunu incelemek için, TMC'ler requimod R848 ile bir gecede uyarıldı. TMCs, mavi çizilmiş, ifn Lambda 2/3 ve IL-8 dışında test edilen tüm sitokinler üretti, üretim PBMCs daha düşük olmasına rağmen, yeşil çizilmiş.R848 stimülasyonunu karşılaştırarak kat artar stimülasyonu kırmızı ile belirtilir. Saflaştırılmış ve izole TMCs, mavi, ve bademcik doku blokları, turuncu, Influenza A virüsü ile 24 saat boyunca uyarıldı, IAV. IFN üretimi TMC'lerde saptandı, ancak doku bloklarının süpernatantında doku eksplandanlarının sitokin salgılanması ve hücre aktivasyonu çalışmaları için en iyi model olmadığını gösteren bir yapıda değil.Toksik ilaç C1 ile ön kuluçka ve R848 ile stimülasyon sonra, TMCs ve PBMCs canlılık için tsayed edildi. TMC'ler C1'e karşı daha duyarlıydı. Bu, gelecekteki tedavilerde yeni ilaçların sadece hücre hatları, PBMCs veya doku eksplorleri üzerinde değil, dokulardan gelen hücrelerde test edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu prosedür bize tam kandan PBMCs gibi TMCs kullanmak ve belirli bir hücre tipi, hücre kültürü, akış sitometri veya donma saflaştırma gibi aynı hücresel deneyler gerçekleştirmek için izin verir.TMC'lerin izolasyonları, mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde sekonder lenfoid organlarda immün yanıtı ilgili bir modelde daha iyi karakterize etmeyi mümkün kılmıştır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Bir Galleria mellonella Oral yönetim modeli için Study Commensal-Induced doğuştan gelen bağışıklık yanıtı

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...