Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

ج.- ل.ب. كتب ونقح المخطوطة. صمم جميع المؤلفين التجارب. J.-L.B. أجرى التجارب والتحليلات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة K22AI112816 وR21AI139968 منحة لA.S. ومن قبل جامعة كاليفورنيا. ن. م. هـ-ك. تم دعمه من قبل زمالات لوندبيك R220-2016-860 و R251-2017-1070. ولم يكن للممولين أي دور في قرار تقديم العمل للنشر. ليس لدينا مصالح متنافسة لنعلنها

1. إعداد ألواح أجار يحتشدون لP. aeruginosa يحتشدون الوقت الفاصل التصوير
<ol><li>إعداد 1 L من 5x M8 الحد الأدنى وسائل الإعلام في زجاجة بإضافة 64 غرام من نا2HPO4• 7H2O، 15 غرام من KH2PO4،و 2.5 غرام من NaCl في 500 مل الماء المقطر المزدوج (ddH2O). ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 1 L مع ddH?...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

يركز هذا البروتوكول على تقليل التباين في لوحات الاجار المحتشدة وتوفير طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة للحصول على صور الفاصل الزمني لP. aeruginosa يحتشدون ويستجيبون للإجهاد. يمكن توسيع هذا الإجراء لتصوير الأنظمة البكتيرية الأخرى عن طريق تكييف تكوين الوسائط وظروف النمو. لP. aeruginosa، على الر?...

يحتشدون هو شكل جماعي من الحركة البكتيرية المنسقة التي تزيد من مقاومة المضادات الحيوية وإنتاج عوامل الفوعة في المضيف1،2،3. يحدث هذا السلوك متعدد الخلايا على الأسطح شبه الصلبة التي تشبه تلك الطبقات المخاطية التي تغطي الأغشية الظهارية في الرئتين4،5. يتم إنتاج المواد البيولوجية السطحية عادة من قبل السكان يحتشدون للتغلب على التوتر السطحي على الأسطح ويتم تنظيم إنتاج هذه من قبل أنظمة الإشارات الخلايا المعقدة، والمعروفة أيضا باسم استشعار النصاب6،7،8. العديد من أنواع البكتيريا قادرة على يحتشدون، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، المكورات العنقودية أوريوس، والإشريكية القولونية9،10،11،12. الأنماط المحتشدة التي تخلقها البكتيريا متنوعة وتتأثر بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للطبقة السطحية بما في ذلك تكوين المغذيات والمسامية والرطوبة13،14. بالإضافة إلى خصائص السطح، تؤثر درجة حرارة النمو والرطوبة المحيطة على عدة جوانب من الديناميكيات الدافئة، بما في ذلك معدل الاحترار والأنماط12،13،14،15. تخلق متغيرات النمو التي تؤثر على الاحترار تحديات تؤثر على قابلية الاستنساخ التجريبي والقدرة على تفسير النتائج. هنا ، نحن نصف طريقة موحدة بسيطة لمراقبة ديناميات أسراب البكتيريا من خلال التصوير الفاصل الزمني. تصف الطريقة كيفية التحكم في ظروف النمو الحرجة التي تؤثر بشكل كبير على تطور الاحترار. بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتحليل سرب، وهذا الأسلوب التصوير الفاصل الزمني تمكن تتبع حركية أسراب متعددة في وقت واحد خلال فترات طويلة من الزمن ومع دقة عالية. وتحسن هذه الجوانب من عمق البيانات التي يمكن الحصول عليها من أسراب الرصد وتيسر تحديد العوامل التي تؤثر على الاحترار.
يسهل الاحترار في P. aeruginosa من خلال إنتاج وإطلاق الرهامنوبيدات و3-(3-هيدروكسي الكانويللوكسي) الأحماض الهلوليك فيالمنطقةالمحيطة 6,16. إن إدخال الإجهاد الناجم عن التركيزات شبه المميتة للمضادات الحيوية أو العدوى بفيروس الفاتج يؤثر على تنظيم الأسراب. على وجه الخصوص، هذه الضغوط تحفز P. aeruginosa لإطلاق جزيء استشعار النصاب 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone، المعروف أيضا باسم إشارة الكينوالون السودوموناس (PQS)17،18. في المقايسات سرب التي تحتوي على مجموعتين من أسراب, PQS التي تنتجها السكان الناجمة عن الإجهاد يصد أسراب غير المعالجة من دخول المنطقة التي تحتوي على الإجهاد(الشكل 1). هذه الاستجابة الإجهاد الجماعي يشكل نظام إشارة الاتصالات الخطر الذي يحذر P. aeruginosa حول التهديدات القريبة18,19. آثار الإجهاد على P. aeruginosa، وتفعيل استجابة الإجهاد الجماعية ، وتنافر الأسراب يمكن تصورها باستخدام طريقة التصوير الفاصل الزمني الموصوفة هنا. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية: (1) إعداد لوحات أجار لليحتشّاب، (2) الثقافة P. aeruginosa لهذين النوعين من المقالات (المقالات التقليدية أو المقايسات الجماعية للاستجابة للإجهاد)(الشكل 1)،(3) الحصول على صور الفاصل الزمني، و(4) استخدام ImageJ لتجميع وتحليل الصور.
لفترة وجيزة، رصدت P. aeruginosa من ثقافة بين عشية وضحاها في منتصف لوحة أجار يحتشدون في حين رصدت P. aeruginosa التي يتم إصابة phage أو تعامل مع المضادات الحيوية في مواقع الأقمار الصناعية. يتم رصد تطور P. aeruginosa يحتشدون على ماسح ضوئي مسطح وثيقة المستهلك التي يتم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية تنظم الرطوبة. يتم التحكم في الماسح الضوئي من خلال برنامج يقوم تلقائيًا بمسح اللوحات على فترات منتظمة خلال فترة نمو السرب ، عادة ً ما تكون 16-20 ساعة. هذه الطريقة تسفر عن أشرطة الفيديو الفاصل الزمني المتزامنة تصل إلى ستة لوحات 10 سم يحتشدون. يتم تجميع الصور في أفلام ويتم قياس نفور الأسراب من قبل السكان الناجمعن الإجهاد باستخدام برنامج ImageJ المتاح بحرية. ويولى اهتمام خاص لضمان الاتساق والاستنساخ بين مختلف التجارب المحتشدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

يحتشدون هو شكل من أشكال حركية السطح لوحظ في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa والإشريكية القولونية. هنا ، تتحرك مجموعات كثيفة من البكتيريا على مسافات كبيرة في مجتمعات مميزة على شكل وترلي على مدار ساعات. الدفء حساس لعدة عوامل بما في ذلك الرطوبة المتوسطة والرطوبة ومحتوى المغذيات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استجابة الإجهاد الجماعية ، التي لوحظت في P. aeruginosa التي يتم الضغط عليها من خلال المضادات الحيوية أو البكتيريا (phage) ، تصد أسراب من الاقتراب من المنطقة التي تحتوي على الإجهاد. وتتناول الأساليب الموصوفة هنا كيفية التحكم في العوامل الحرجة التي تؤثر على الاحترار. نقدم طريقة بسيطة لرصد الديناميكيات المحتشدة والاستجابة الجماعية للإجهاد بدقة زمنية عالية باستخدام ماسح ضوئي للمستندات المسطحة ، ووصف كيفية تجميع وإجراء تحليل كمي للأسراب. توفر هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة قياسًا كميًا دقيقًا وجيد التحكم فيه للاحترار ويمكن توسيعنطاقها لتشمل أنواعًا أخرى من المقالات النمو القائمة على الصفائح والأنواع البكتيرية.

يتم تمثيل الخطوات اللازمة لنمو P. aeruginosa، والإجهاد الخلايا ، وصورة لوحات أجار يحتشدون في الشكل 1. نحن تلقيح مستعمرة واحدة من البرية من نوع P. aeruginosa UCBPP-PA14 سلالة من لوحة LB-agar في 2 مل من مرق LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ورصدت 5 ميكرولتر في وسط لوحة أجار يحتشدون. يكشف تصوير هذه...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

نحن بالتفصيل طريقة بسيطة لإنتاج أفلام عالية الدقة الفاصل الزمني من أسراب Pseudomonas aeruginosa التي تستجيب لbacteriophage (phage) والإجهاد المضادات الحيوية باستخدام ماسح ضوئي وثيقة مسطحة. هذا الإجراء هو طريقة سريعة وبسيطة لرصد ديناميات يحتشدون ويمكن تكييفها لدراسة حركية ونمو الأنواع البكتيرية الأخرى.

تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج أفلام الوقت الفاصل من Pseudomonas aeruginosa يحتشدون والتقاط النفور من سرب من bacteriophage أو المضادات الحيوية. أفلام الفاصل الزمني التقاط ديناميات مفصلة من الاستجابة يحتشدون على المضادات الحيوية والجرثومة والتقنية يتطلب فقط مزيل الرطوبة والكمبيوتر والحاضنة ، وماسحة ضوئية الوثائق. لإعداد لوحات أغار يحتشد لP.aeruginosa يحتشدون التصوير الفاصل الزمني، استخدم ماصة 25 ملليلتر لإضافة 20 ملليلتر من محلول أغار المحتشد لكل طبق بيتري التجريبي قطره 10 سنتيمترات.ضع اللوحات في كومة واحدة مع أغطية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بدوره على مزيل الرطوبة لتقليل الرطوبة النسبية للغرفة إلى 40-50٪ عندما تتوطد أجار، وتجفيف لوحات أجار يحتشد لمدة 30 دقيقة إضافية في غطاء تدفق لارينار مع الأغطية قبالة ووجه حتى في 300 قدم مكعب في الدقيقة مع رطوبة نسبية 40-50٪ في درجة حرارة الغرفة. ثم تخزين المجففة احتشد لوحات أجار في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.لاحتشاد أغار الطلاء، عقد طرف ماصة P20 محملة بخمسة microliters من ثقافة P.aeruginosa بين عشية وضحاها في زاوية 10-45 درجة 2-1/2 سم فوق مركز لوحة واحدة يحتشد والاكتئاب المكبس إلى أول وقف لمس أجار مع قطرة السائل فقط. استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة. لوحة عدوى phage، أول مزيج 30 ميكرولتررس من بين عشية وضحاها مثقف P.aeruginosa مع ستة microliters من واحد مرات 10 إلى 12 وحدات تشكيل البلاك لكل ملليلتر من phage DMS3 فير وتضيف على الفور ستة ميكرولترات من خليط P.aeruginosa الفاترة في ستة مواقع الأقمار الصناعية متساوية 2.8 سمين دائرة متحدة المركز كما هو موضح.استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة. لصفائح العلاج بالمضادات الحيوية، مزيج 30 ميكرولترات من بين عشية وضحاها مثقف P.aeruginosa مع التركيز المناسب وحجم المضادات الحيوية ذات الاهتمام وإضافة على الفور ستة ميكرولترات من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية في ستة مواقع الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سنتيمتر متحدة المركز حول مركز الطبق. استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة.عندما تم مطلي جميع الثقافات، استبدل أغطية طبق بيتري الواضحة بأغطية سوداء مصنوعة خصيصًا. ضع بعناية لوحات أجار المحتشدة على ماسح ضوئي في حاضنة 37 درجة مئوية مع حمام مائي 10 لتر للحفاظ على الرطوبة عند 75٪ بعد وضع اللوحات في الماسح الضوئي وفتح الملف وحفظ الإعدادات لتعيين مسار الادخار للصور وانقر على المسح الضوئي و موافق على فترات 30 دقيقة. لأتمتة الحصول على الصورة، استخدم برنامج البرمجة النصية.حدد كلاً من المسح الضوئي الخمول والمسح الضوئي المفرد وانقر بزر الماوس الأيمن على المسح الضوئي الخمول، ثم انقر بزر الماوس الأيسر على تمكين. في نهاية الحضانة ، استيراد جميع الصور الممسوحة ضوئيا في ImageJ. في إطار خيارات التسلسل، سيشير عدد الصور إلى عدد الصور المحددة.الحفاظ على بدء الصورة في واحدة لتبدأ من الصورة الأولى في المجلد والصور مقياس في 100 ٪ للحفاظ على الحجم الأصلي للصور. انقر فوق سرية إلى RGB للحفاظ على الصور في اللون. اترك استخدام المكدس الظاهري دون تحديد وانقر فوق موافق لتحميل الصور.انقر فوق ملف، حفظ باسم و AVI لدمج الصور في ملف AVI. ضبط الضغط إلى JPEG ومعدل الإطارات إلى خمسة إطارات في الثانية. ثم احفظ الفاصل الزمني AVI في مجلد التخزين المناسب.تصوير الفاصل الزمني لمستعمرة واحدة من نوع البرية P.aeruginosa من لوحة LB agar في مرق LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ورصدت في وسط لوحة أغار يحتشد يكشف عن نمو أولي في شكل مستعمرة في وسط لوحة التي تنتشر في tendrils شعاعي من المستعمرة. تنتقل الأسراب من مركز صحون الأجار المحتشدة إلى المحيط الخارجي ويتم صدها من خلال إشارة الإجهاد المنبعثة من البكتيريا التي كانت مصابة بالفاغات أو عولجت بـ Gentamycin. لا يسبب Phages أو Gentamycin رصدت وحدها في مواقع الأقمار الصناعية السكان يحتشدون لتجنب هذه المناطق.استخدام ماصة 25 ملليلتر لضمان أن لوحات أجار يحتشدون تحتوي على 20 ملليلتر بالضبط. من المهم أيضا لضبط الوقت تجفيف لوحة وفقا للبيئة المختبرية. تقنية لدينا تمكننا من تصور أنماط حشد العام من السكان pseudomonas aeruginosa.والهدف التالي هو رصد حركة الخلية الفردية باستخدام المجهر برايتفيلد.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...