Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

י.-ל ג'ונסון, א. י., ו. מ. ק. ה. כתב ושינו את כתב היד. כל המחברים תכננו את הניסויים. ג.-ל ג'ונסון ביצעו את הניסויים והניתוח. עבודה זו נתמכת על ידי K22AI112816 בפרס NIH ו-R21AI139968 מענק ל-ס. י. ובאוניברסיטת קליפורניה. נ. מ. ח-ק בתמיכת מלגות לונלבק R220-2016-860 וR251-2017-1070. לתורמים לא היה כל תפקיד בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום. . אין לנו אינטרסים מתחרים להכריז

1. הכנת לוחות שורצים במשך P. aeruginosa שורצים זמן הדמיה
<ol><li>להכין 1 L של 5x M8 מינימום מדיה בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 64 g של Na2hpo4• 7h2O, 15 גרם של KH2פו4, ו 2.5 g של הנאל ב 500 mL כפול מים מזוקקים (ddh2O). כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-1 ל' עם תוספת ddH2O. אוטוקלב כדי לעקר ו...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

פרוטוקול זה מתמקד בצמצום השונות בלוחות שורצים באגר ומספק שיטה פשוטה ובעלות נמוכה לרכישת תמונות בזמן של P. aeruginosa שורצים ומגיבים ללחץ. הליך זה ניתן להרחיב את התמונה מערכות בקטריאלי אחרות על ידי התאמת הרכב התקשורת ותנאי גדילה. עבור P. aeruginosa, למרות M9 או בינוני מינימלי FAB יכול לשמש כדי ל...

שורצים היא צורה קולקטיבית של תנועתיות בקטריאלי מתואמת המגביר עמידות לאנטיביוטיקה והפקת גורמי התקפה אלימה במחשב המארח1,2,3. התנהגות זו רב-תאיים מתרחשת על משטחים חצי מוצקים הדומים לאלה של שכבות ריריות המכסים ממברנות אפיתל בריאות4,5. ביוסוררים מיוצרים בדרך כלל על ידי אוכלוסיות שורצים כדי להתגבר על מתח פני השטח על משטחים ועל הייצור של אלה מוסדר על ידי תא התא מורכב איתות מערכות, הידוע גם כ-quorum חישה6,7,8. מינים רבים של חיידקים מסוגלים שורצים, כולל הפסאודומונס aeruginosa, סטייהולוקוקוס האוראוס, ואסאנכיה קולי9,10,11,12. דפוסי השמון שנוצרו על ידי חיידקים הם מגוונים ומושפעים התכונות הפיזיות והכימיות של שכבת פני השטח כולל הרכב מזינים, פורמים, ולחות13,14. בנוסף למאפייני פני השטח, טמפרטורת הצמיחה ולחות הסביבה משפיעים על מספר היבטים של שורצים, כולל שיעור שורצים ודפוסים12,13,14,15. משתני הצמיחה המשפיעים על שורצים ליצור אתגרים המשפיעים על התוכסות ניסיוני ואת היכולת לפרש את התוצאות. כאן, אנו מתארים שיטה סטנדרטית פשוטה כדי לפקח על הדינמיקה של נחילי בקטריאלי דרך הדמיה זמן לשגות. השיטה מתארת כיצד לשלוט בתנאי גדילה קריטיים המשפיעים באופן משמעותי על ההתקדמות של שורצים. בהשוואה לשיטות מסורתיות של ניתוח נחיל, זו שיטת הדמיה הזמן מאפשר לעקוב אחר תנועתיות של נחילים מרובים במקביל במהלך פרקי זמן ארוכים עם רזולוציה גבוהה. היבטים אלה משפרים את עומק הנתונים שניתן להשיג מהנחילים לניטור ולהקל על זיהוי גורמים המשפיעים על שורצים.
שורצים P. aerginosa הוא הקלה דרך הייצור ושחרורו של הרחמנויפידים ו-3-(3-הידרוקסילואנוק) חומצות אלקאנומית לאזור שמסביב6,16. המבוא של לחץ מתוך ריכוזי תת קטלני של אנטיביוטיקה או זיהום על ידי וירוס phage משפיע על הארגון של נחילים. במיוחד, הלחצים האלה לגרום P. aeruginosa לשחרר את מולקולה חישה 2-הפלטיל-3-הידרוxy-4-quinolone, הידוע גם בשם האות הפסאודומונס quinolone (pqs)17,18. בתוך הנחיל אומר כי מכילים שתי אוכלוסיות של נחילים, PQS המיוצר על ידי האוכלוסייה הנגרמת לחץ דוחה נחילים מטופל מלהיכנס לאזור המכיל את הלחץ (איור 1). תגובת הדחק הקולקטיבית מהווה מערכת מסוכנת לתקשורת איתות המזהירה את P. aeruginosa על איומים סמוכים18,19. השפעת הלחץ על P. aeruginosa, הפעלת תגובת הלחץ הקולקטיבי, ואת הדחייה של נחילים ניתן לדמיין באמצעות שיטת הדמיה בזמן שתוארה כאן. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד: (1) להכין צלחות אגר עבור שורצים, (2) תרבות P. aeruginosa עבור שני סוגים של בחני (שורצים מסורתיים או תגובת הלחץ קולקטיבית התגובה) (איור 1), (3) לרכוש תמונות זמן, ו (4) להשתמש imagej לקמפל ולנתח את התמונות
בקצרה, P. aerginosa מן התרבות לילה הוא הבחין באמצע הלוח שורצים בזמן P. aeruginosa כי הם נגועים phage או מטופלים עם אנטיביוטיקה מאותרת בעמדות לווין. ההתקדמות של P. aeruginosa שורצים מנוטרים על מסמך הצרכן סורק שנמצא ממוקם בתוך לחות מוסדר 37 ° c אינקובטור. הסורק נשלט על ידי תוכנה שסורקת באופן אוטומטי את הצלחות במרווחי זמן קבועים על תקופת הצמיחה נחיל, בדרך כלל 16 – 20 h. שיטה זו מפיקה במקביל סרטוני וידאו של עד 6 10 ס"מ לוחות שורצים. התמונות מצולמות בסרטים והדחייה של הנחילים על ידי אוכלוסיות מוחלשות מקוונזת באמצעות תוכנת ImageJ זמינה באופן חופשי. שיקול מיוחד ניתן כדי להבטיח עקביות והתמדה בין ניסויים שורצים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

שורצים היא צורה של תנועתיות פני השטח שנצפו במינים בקטריאליים רבים, כולל הפסאודומונס aeruginosa ואסאנכיה קולי. כאן, אוכלוסיות צפופות של חיידקים לנוע מעל מרחקים גדולים בקהילות בצורת tendril אופייני במהלך השעות. שורצים רגישים למספר גורמים, כולל לחות בינונית, לחות ותוכן תזונתי. בנוסף, תגובת הלחץ הקולקטיבי, אשר נצפתה ב P. aeruginosa , כי הם הדגיש על ידי אנטיביוטיקה או בקטביאג (phage), דוחה נחילים מתקרבים לאזור המכיל את הלחץ. השיטות המתוארות כאן כתובות כיצד לשלוט על הגורמים הקריטיים המשפיעים על שורצים. אנו מציגים שיטה פשוטה לפקח על שורצים הדינמיקה ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי עם ברזולוציה גבוהה בזמן באמצעות סורק מסמך מסורק, ולתאר כיצד לקמפל ולבצע ניתוח כמותי של נחילים. שיטה פשוטה וחסכונית זו מספקת כימות מדויקת ומבוקרת היטב של שורצים ועשויים להיות מורחבים לסוגים אחרים של הצלחת הצמיחה המבוססת על לוח ומינים חיידקי.

השלבים לצמוח P. aeruginosa, להדגיש את התאים, ואת התמונה לוחות שורצים מיוצגים באיור 1. חיסלנו מושבה אחת של מסוג פראי P. aeruginosa ucbpp-PA14 המתח מצלחת lb-אגר ב 2 מ ל המרק lb לילה ב 37 ° c ו הבחין 5 μl במרכז הצלחת שורצים. הדמיה של הצלחת הזמן מגלה את הצמיחה הראשונית בצורה של מושבה במרכז ולאחר מכן מת?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

אנו לפרט שיטה פשוטה כדי לייצר ברזולוציה גבוהה זמן לפקיעה סרטים של פסאודומונס aeruginosa נחילים כי להגיב בקטיויוג'ה (phage) ומתח אנטיביוטי באמצעות סורק מסמך מסורק. הליך זה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניטור שורצים הדינמיקה יכול להיות מותאם ללמוד תנועתיות וצמיחה של מינים חיידקיים אחרים.

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייצר סרטים לשגות זמן של Pseudomonas aeruginosa שורץ וללכוד את הדחייה של נחיל על ידי בקטריופאג 'או אנטיביוטיקה. הסרטים לשגות זמן ללכוד את הדינמיקה המפורטת של התגובה שורצת אנטיביוטיקה ו bacteriophage ואת הטכניקה רק דורש dehumidifier, מחשב, אינקובטור, וסורק מסמכים. כדי להכין צלחות אגר שורצות עבור P.aeruginosa שורץ זמן לשגות הדמיה, להשתמש פיפטה 25 מיליליטר להוסיף 20 מיליליטר של פתרון אגר נוהר לכל צלחת ניסיונית 10 ס"מ קוטר פטרי.מניחים את הצלחות בערימה אחת עם מכסים במשך שעה בטמפרטורת החדר. הפעל את dehumidifier כדי להקטין את הלחות היחסית של החדר ל 40-50% כאשר אגר התגבש, לייבש את צלחות אגר שורץ במשך 30 דקות נוספות ברדס זרימה למינארית עם המכסים את הפנים כלפי מעלה ב 300 מטרים מעוקבים לדקה עם 40-50% לחות יחסית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן אחסנו את צלחות הגר היובשות בארבע מעלות צלזיוס עד 24 שעות.עבור ציפוי אגר נוהר, להחזיק קצה פיפטה P20 טעון עם חמישה microliters מתרבות P.aeruginosa לילה בזווית 10-45 מעלות 2-1/2 ס"מ מעל מרכז צלחת שורצת אחת ולדכא את הבוכנה כדי להפסיק הראשון לגעת אגר עם טיפה נוזלית בלבד. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות. כדי לצחצח זיהום פאג', תחילה לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם שישה microliters של אחד פעמים 10 כדי 12 לוח להרכיב יחידות למיליליטר של פאג DMS3 vir ומיד להוסיף שישה microliters של תערובת פאג P.aeruginosa בשש עמדות לווין שקילה על 2.8 סנטימטרים קונצנטרייםהשתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על פני צלחות אגר שונות. כדי צלחת טיפולים אנטיביוטיים, לערבב 30 microliters של P.aeruginosa בתרבות לילה עם הריכוז והנפח המתאים של אנטיביוטיקה של עניין ומיד להוסיף שישה microliters של חיידקים שטופלו באנטיביוטיקה בשש עמדות לווין שיווי משקל על מעגל רכזי רדיוס 2.8 ס"מ על מרכז המנה. השתמש בתבנית כדי למקם את הנקודה באופן עקבי על-פני צלחות הגר השונות.כאשר כל התרבויות כבר מצופה, להחליף את מכסי צלחת פטרי ברור עם מכסים שחורים בהתאמה אישית. בזהירות למקם את צלחות אגר שורץ על סורק באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים 10 ליטר כדי לשמור על הלחות ב 75% לאחר הצבת הצלחות לתוך הסורק, לפתוח את הקובץ ולשמור הגדרות כדי להגדיר את נתיב השמירה עבור התמונות ולחץ על סריקה וסדר במרווחים של 30 דקות. כדי להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית, השתמש בתוכנת ה- Scripting.בחר הן סריקה לא פעילה והן סריקה בודדת ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סריקה לא פעילה ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על זמין. בסוף הדגירה, יבא את כל התמונות הסרוקות לתוך ImageJ. בחלון אפשרויות הרצף, מספר התמונות יציין את מספר התמונות שנבחרו.המשך להפעיל את התמונה באחת כדי להתחיל מהתמונה הראשונה בתיקיה ואת תמונות קנה המידה ב- 100%כדי לשמר את הגודל המקורי של התמונות. לחצו על 'סמוי' ל-RGB כדי לשמור על צבע התמונות. השאירו את האפשרות 'השתמש בערימה וירטואלית' לא מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר' לטעינת התמונות.לחץ על קובץ, שמור בשם ו- AVI כדי למזג את התמונות לקובץ AVI. התאימו את הדחיסה ל- JPEG ולקצב המסגרות לחמש מסגרות לשניה. לאחר מכן שמור את זמן האחסון של AVI לתיקיית האחסון המתאימה.הדמיה לשגות זמן של מושבה אחת של P.aeruginosa מסוג פראי מצלחת אגר LB במרק LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו הבחין למרכז צלחת אגר שורצת מגלה צמיחה ראשונית בצורה של מושבה במרכז הצלחת המתפשטת בגידים באופן רדיני מהמושבה. נחילים נעים ממרכז צלחות הגר הנוהרים לפריפריה ונודפים על ידי אות לחץ הנפלט על ידי החיידקים שנדבקו בפאג'ים או טופלו בגנטמיצין. פאג'ים או ג'נטמיצין הבחינו לבד בעמדות הלוויין אינם גורמים לאוכלוסיות שורצות להימנע מאזורים אלה.השתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי להבטיח כי צלחות אגר שורץ מכילים בדיוק 20 מיליליטר. חשוב גם להתאים את זמן הייבוש של הצלחת בהתאם לסביבת המעבדה. הטכניקה שלנו מאפשרת לנו לדמיין את הדפוסים הנוהרים הכוללים של אוכלוסיות אווירוגינוזה פסאודומונס.המטרה הבאה היא לפקח על תנועתיות תאים בודדת באמצעות מיקרוסקופיה של ברייטפילד.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...