Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. scritto e rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno progettato gli esperimenti. J.--L.B. ha eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH K22AI112816 e R21AI139968 ad A.S. e dall'Università della California. N.M.H-K. è stato supportato da Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella decisione di presentare i lavori per la pubblicazione. Non abbiamo interessi contrastanti da dichiarare.

1. Preparazione piastre di agar sciame per P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
<ol><li>Preparare 1 L di 5x M8 supporti minimi in una bottiglia di vetro aggiungendo 64 g di Na2HPO4s 7H2O, 15 g di KH2PO4e 2,5 g di NaCl in 500 mL di acqua a doppia distillazione (ddH2O). Regolare il volume finale a 1 L con ulteriori ddH2O. Autoclave per sterilizzare e conservare i supporti liquidi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare 100 mL d...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

Questo protocollo si concentra sulla riduzione al minimo della variabilità nelle piastre di agar brulicanti e sulla fornitura di un metodo semplice e a basso costo per acquisire immagini time-lapse di P. aeruginosa brulicante e rispondendo allo stress. Questa procedura può essere estesa per l'immagine di altri sistemi batterici adattando la composizione dei media e le condizioni di crescita. Per P. aeruginosa, anche se M9 o FAB mezzo minimo può essere utilizzato per indurre sciami16...

Lo sciame è una forma collettiva di motilità batterica coordinata che aumenta la resistenza agli antibiotici e la produzione di fattori di virulenza nell'host1,2,3. Questo comportamento multicellulare si verifica su superfici semi-solide che assomigliano a quelle degli strati mucose che coprono le membrane epiteliali nei polmoni4,5. I biosurfactants sono comunemente prodotti da popolazioni brulicanti per superare la tensione superficiale sulle superfici e la produzione di questi è regolata da complessi sistemi di segnalazione cellulare, noti anche come quorum sensing6,7,8. Molte specie di batteri sono in grado di sciamare, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. I modelli brulicanti creati dai batteri sono diversi e sono influenzati dalle proprietà fisiche e chimiche dello strato superficiale tra cui la composizione dei nutrienti, porosità, e l'umidità13,14. Oltre alle proprietà della superficie, la temperatura di crescita e l'umidità ambiente influenzano diversi aspetti della dinamica dello sciame, tra cui il tasso di bruliè e modelli12,13,14,15. Le variabili di crescita che influenzano lo sciame creano sfide che influenzano la riproducibilità sperimentale e la capacità di interpretare i risultati. Qui, descriviamo un semplice metodo standardizzato per monitorare la dinamica degli sciami batterici attraverso l'imaging time-lapse. Il metodo descrive come controllare le condizioni di crescita critiche che influenzano in modo significativo la progressione dello sciame. Rispetto ai metodi tradizionali di analisi dello sciame, questo metodo di imaging time-lapse consente di monitorare la motilità di più sciami contemporaneamente durante lunghi periodi di tempo e ad alta risoluzione. Questi aspetti migliorano la profondità dei dati che possono essere ottenuti monitorando sciami e facilitano l'identificazione dei fattori che influenzano lo sciame.
Lo sciame in P. aeruginosa è facilitato attraverso la produzione e il rilascio di rhamnolipids e 3-(3-idrossi-idrossinoyloxy)accomodanti nell'area circostante6,16. L'introduzione dello stress da concentrazioni subletali di antibiotici o infezioni da virus del fago influisce sull'organizzazione di sciami. In particolare, queste sollecitazioni inducono P. aeruginosa a rilasciare la molecola di rilevamento quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, noto anche come il segnale di quinolone Pseudomonas (PQS)17,18. Nei test sciami che contengono due popolazioni di sciami, il PQS prodotto dalla popolazione indotta dallo stress respinge gli sciami non trattati dall'entrare nell'area contenente lo stress (Figura 1). Questa risposta collettiva allo stress costituisce un sistema di segnalazione di comunicazione di pericolo che avverte P. aeruginosa sulle minacce vicine18,19. Gli effetti dello stress su P. aeruginosa, l'attivazione della risposta collettiva allo stress, e la repulsione degli sciami possono essere visualizzati utilizzando il metodo di imaging time-lapse descritto qui. Il protocollo qui descritto spiega come: (1) preparare piastre di agar per brulicare, (2) cultura P. aeruginosa per due tipi di analisi (saggi tradizionali sciami o saggi collettivi di risposta allo stress) (Figura 1), (3) acquisire immagini time-lapse e (4) utilizzare ImageJ per compilare e analizzare le immagini.
In breve, P. aeruginosa da una coltura durante la notte è avvistato nel mezzo di una piastra di agar brulicante mentre P. aeruginosa che sono infettati da fago o trattati con antibiotici sono avvistati nelle posizioni satellitari. La progressione dello sciame di P. aeruginosa è monitorata su uno scanner piano piano del documento di consumo che viene collocato in un'incubatrice regolata dall'umidità di 37 gradi centigradi. Lo scanner è controllato da un software che esegue automaticamente la scansione delle piastre a intervalli regolari durante il periodo di crescita dello sciame, in genere 16-20 h. Questo metodo produce video time-lapse simultanei fino a sei piastre brulicanti di 10 cm. Le immagini vengono compilate in filmati e la repulsione di sciami da parte di popolazioni indotte da stress è quantificata utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile. Si fa particolare attenzione a garantire la coerenza e la riproducibilità tra i diversi esperimenti di brulicante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

Lo sciame è una forma di motilità superficiale osservata in molte specie batteriche tra cui Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli. Qui, le popolazioni dense di batteri si muovono su grandi distanze in comunità a forma di tendine nel corso delle ore. Lo sciame è sensibile a diversi fattori, tra cui umidità media, umidità e contenuto di nutrienti. Inoltre, la risposta collettiva allo stress, che si osserva in P. aeruginosa che sono stressati da antibiotici o batteriofagi (fago), respinge sciami dall'avvicinarsi all'area contenente lo stress. I metodi descritti di seguito riguardano il modo in cui controllare i fattori critici che influiscono sullo sciame. Introduciamo un metodo semplice per monitorare le dinamiche dello sciame e la risposta collettiva allo stress con alta risoluzione temporale utilizzando uno scanner di documenti piano e descriviamo come compilare ed eseguire un'analisi quantitativa degli sciami. Questo metodo semplice ed economico fornisce una quantificazione precisa e ben controllata dello sciame e può essere esteso ad altri tipi di saggi di crescita a base di lamiere e specie batteriche.

I passaggi per far crescere P. aeruginosa,stressare le cellule e immagine le piastre di agar brulicanti sono rappresentati nella Figura 1. Abbiamo inoculato una singola colonia di ceppo selvatico di P. aeruginosa UCBPP-PA14 da una piastra LB-agar in 2 mL di brodo LB durante la notte a 37 gradi centigradi e abbiamo individuato 5 l al centro della piastra di agar brulicante. L'imaging time-lapse di questa piastra rivela la crescita iniziale sotto forma di colonia al centro e poi la diffus...

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Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Dettagliamo un metodo semplice per produrre filmati time-lapse ad alta risoluzione di sciami di Pseudomonas aeruginosa che rispondono a batteriofa (fago) e stress antibiotico utilizzando uno scanner di documenti piatti. Questa procedura è un metodo semplice e veloce per monitorare le dinamiche dello sciame e può essere adattata per studiare la motilità e la crescita di altre specie batteriche.

L'imaging time-lapse di sciami batterici e la risposta allo stress collettivo

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Questo protocollo può essere utilizzato per produrre filmati time-lapse di Pseudomonas aeruginosa brulicante e per catturare la repulsione dello sciame da batteriofago o antibiotici. I film time-lapse catturano la dinamica dettagliata della risposta brulicante agli antibiotici e ai batteriofagi e la tecnica richiede solo un deumidificatore, un computer, un incubatore e uno scanner di documenti. Per preparare piastre di agar brulicanti per l'imaging time-lapse di P.aeruginosa, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per aggiungere 20 millilitri di soluzione di agar brulicante a ogni piastra di Petri sperimentale di 10 centimetri di diametro.Posizionare le piastre in un'unica pila con coperchi per un'ora a temperatura ambiente. Accendere un deumidificatore per ridurre l'umidità relativa della stanza al 40-50%Quando l'agar si è solidificato, asciugare le piastre di agar brulicanti per altri 30 minuti in un cappuccio di flusso laminare con i coperchi spenti e affrontare a 300 piedi cubi al minuto con un'umidità relativa del 40-50% a temperatura ambiente. Quindi conservare le piastre di agar brulicanti essiccate a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore.Per sciamare la placcatura dell'agar, tenere una punta di pipetta P20 caricata con cinque microlitri da una coltura di P.aeruginosa durante la notte con un angolo di 10-45 gradi di 2-1/2 centimetri sopra il centro di una piastra brulicante e deprimere lo stantuffo alla prima fermata di toccare l'agar con solo la goccia liquida. Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente attraverso le diverse piastre di agar brulicanti. Per placcare un'infezione da fago, mescolare prima 30 microlitri di P.aeruginosa coltivata durante la notte con sei microlitri di uno per 10 alle 12 unità di formatura della placca per millilitro di fago DMS3 vir e aggiungere immediatamente sei microlitri della miscela di fago P.aeruginosa in sei posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico di raggio di 2,8 centimetri come dimostrato.Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente su diverse piastre di agar brulicanti. Per placcare i trattamenti antibiotici, mescolare 30 microlitri di P.aeruginosa coltivata durante la notte con l'appropriata concentrazione e volume dell'antibiotico di interesse e aggiungere immediatamente sei microlitri dei batteri trattati con antibiotici in sei posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico del raggio di 2,8 centimetri attorno al centro del piatto. Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente attraverso le diverse piastre di agar brulicanti.Quando tutte le colture sono state placcate, sostituire i coperchi chiari della piastra di Petri con coperchi neri su misura. Posizionare con cura le piastre di agar brulicanti su uno scanner in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius con un bagno d'acqua da 10 litri per mantenere l'umidità al 75%Dopo aver posizionato le piastre nello scanner, aprire il file e salvare le impostazioni per impostare il percorso di salvataggio per le immagini e fare clic su scansione e OK a intervalli di 30 minuti. Per automatizzare l'acquisizione delle immagini, utilizzare il software di scripting.Selezionare sia la scansione inattiva che la scansione singola e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scansione inattiva, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse su abilitato. Alla fine dell'incubazione, importare tutte le immagini digitalizzate in ImageJ. Nella finestra delle opzioni di sequenza, il numero di immagini indicherà il numero di immagini selezionate.Continua a iniziare l'immagine da una per iniziare dalla prima immagine nella cartella e ridimensiona le immagini al 100% per conservare le dimensioni originali delle immagini. Fare clic su Disartito su RGB per mantenere le immagini a colori. Lasciare l'opzione Usa stack virtuale deselezionata e fare clic su OK per caricare le immagini.Fare clic su file, salva con nome e AVI per unire le immagini in un file AVI. Regola la compressione su JPEG e la frequenza fotogrammi a cinque fotogrammi al secondo. Quindi salvare il time-lapse AVI nella cartella di archiviazione appropriata.L'imaging time-lapse di una singola colonia di P.aeruginosa di tipo selvatico da una piastra di agar LB in brodo LB durante la notte a 37 gradi Celsius e avvistata al centro di una piastra di agar brulicante rivela una crescita iniziale sotto forma di una colonia al centro della piastra che si diffonde nei viticci radialmente dalla colonia. Gli sciami si spostano dal centro delle placche di agar brulicanti alla periferia e vengono respinti da un segnale di stress emesso dai batteri infettati da fagi o trattati con Gentamicina. Fagi o Gentamicina avvistati da soli nelle posizioni satellitari non fanno sì che popolazioni brulicanti evitino queste aree.Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per assicurarsi che le piastre di agar brulicanti contengano esattamente 20 millilitri. È anche importante regolare il tempo di asciugatura della piastra in base all'ambiente di laboratorio. La nostra tecnica ci consente di visualizzare i modelli complessivi di sciame delle popolazioni di Pseudomonas aeruginosa.Il prossimo obiettivo è monitorare la motilità delle singole cellule usando la microscopia Brightfield.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ricerca

Biologia

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