Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

J.-L.B.、A.S.、およびN.M.H-K.原稿を書き、改訂した。すべての著者は実験を設計しました。J.-L.B.は実験と分析を行った。この作品は、NIH賞K22AI112816とR21AI139968助成金によって支えられ、A.S.とカリフォルニア大学によって支えられました。N.M.H-K.ルンドベック・フェローシップR220-2016-860およびR251-2017-1070によって支えられた。資金提供者は、出版のために作品を提出する決定に何の役割も持っていませんでした。私たちは宣言する競合する利益を持っていません。

1. 緑素吸い込みタイムラプスイメージングのための群れの寒天プレートの準備
<ol><li>Na2HPO 4 •7H 2 Oの64 g、KH22PO4の215g、および500 mL二重蒸留水(ddH2O)にNaClの2.5 gを加えることによって、ガラス瓶に5x M8最小培地1 Lを調製します。最終容積を1 Lに調整し、ddH2O. オートクレーブを追加して、液体培地を室温で殺菌および保存します。</...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

このプロトコルは、群れの寒天プレートの変動を最小限に抑え、P.緑素吸砂のタイムラプス画像を取得し、ストレスに応答するための簡単で低コストの方法を提供することに焦点を当てています。この手順は、培地組成および増殖条件を適応させることによって、他の細菌系を画像化するように拡張することができる。P.緑素吸塩の場合、M9またはFABの最小培地は群生<sup class="xref...

群れは、抗生物質耐性を増加させ,、宿主1、2、32における病原性因子の産生を増加させる協調1細菌運動性の集合的形態である。3この多細胞挙動は、肺,4,5の上皮膜を覆う粘膜層に似た半固体表面で起こる。4バイオサーファクタントは、表面の表面張力を克服するために群れの集団によって一般的に生産され、これらの産生は、クォーラム,センシング6、7、87としても知られている複雑な6細胞シグナル伝達システムによって調節される。8緑膿菌、黄色ブドウ球,菌、大腸菌9、10、11、12,10など、多くの種の細菌が群がることができる。11,12細菌によって作成される群れのパターンは多様であり、栄養成分、気孔率、および水分13、14を含む表層の物理的および化学的特性の影響を14受ける。表面特性に加えて、成長温度と周囲湿度は、群れの速度とパターン12、13、14、15,13,14を含む群れのダイナミクスのいくつかの側面に影響を与えます。群れに影響を与える成長変数は、実験再現性と結果を解釈する能力に影響を与える課題を作成します。ここでは、タイムラプスイメージングを通じて細菌群の動態をモニタリングする簡単な標準化方法について述べていきます。この方法では、群れの進行に大きな影響を与える重大な成長条件を制御する方法について説明します。従来の群れの分析方法と比較して、このタイムラプスイメージング法により、長期間にわたって高解像度で複数の群れの運動性を同時に追跡することができます。これらの側面は、群れを監視することで得られるデータの深さを改善し、群れに影響を与える要因の識別を容易にします。
P.緑素吸塩の群れは、周囲の領域6,6、16にラムノリプト脂質および3-(3-ヒドロキシアルカノキシ)アルカノ酸の生産および放出を通じて促進される。抗生物質の亜致死濃度またはファージウイルスによる感染からのストレスの導入は、群れの組織に影響を与える。特に、これらのストレスは、P.エルギノーサがクォーラムセンシング分子2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロンを放出することを誘導し、シュードモナスキノロンシグナル(PQS)17,18とも呼ばれる。17,18群れの2つの集団を含む群れのアッセイでは、ストレス誘発集団によって産生されるPQSは、ストレスを含む領域に入って未処理の群れを撃退する(図1)。この集団ストレス応答は、近くの脅威18、19についてP.緑内鼻波に警告する危険な通信信号システムを19構成する。P.緑素吸い、集団ストレス応答の活性化、および群れの反発に対するストレスの影響は、ここで説明するタイムラプスイメージング法を用いて可視化することができる。ここで説明するプロトコルは、(1)群れのための寒天プレートを準備する方法、(2)2種類のアッセイ(伝統的な群れのアッセイまたは集団ストレス応答アッセイ)のための培養P.エルギノーサ(図1)、(図1)タイムラプス画像の取得、および(4)ImageJを使用して画像をコンパイルして分析する方法を説明しています。
簡単に言えば、一晩培養したP.緑頭症は群がる寒天プレートの真ん中に見られ、ファージに感染したり抗生物質で治療したP.緑素吸い目は衛星位置で発見される。P.緑素吸い込みの進行は、湿度調節された37°Cインキュベーターに置かれた消費者文書フラットベッドスキャナーで監視されます。スキャナーは、群れの成長期間(通常は16〜20時間)にわたって定期的にプレートを自動的にスキャンするソフトウェアによって制御されます。この方法は6つの10 cmの群れの版の同時タイムラプスビデオを得る。画像は映画にコンパイルされ、ストレス誘発集団による群れの反発は、自由に利用できるImageJソフトウェアを使用して定量化される。異なる群れの実験間の一貫性と再現性を確保するために、特別な配慮がなされている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

群れは、緑膿菌や大腸菌を含む多くの細菌種で観察される表面運動性の一形態である。ここでは、細菌の密集した集団は、数時間にわたって特徴的な傾向性の形をしたコミュニティで大きな距離を移動します。群れは、中程度の水分、湿度、栄養素の含有量を含むいくつかの要因に敏感です。さらに、抗生物質やバクテリオファージ(ファージ)によってストレスを受けるP.緑内症で観察される集団ストレス応答は、ストレスを含む領域に近づくから群れを撃退する。ここで説明する方法は、群れの影響を及ぼす重要な要因を制御する方法を説明します。フラットベッド文書スキャナを用いて、群れの動態や高い時間分解能での集合的ストレス応答を監視する簡単な手法を紹介し、群れの定量分析を行う方法を説明する。このシンプルで費用対効果の高い方法は、群れの正確かつ適切に制御された定量を提供し、他のタイプのプレートベースの成長アッセイおよび細菌種に拡張することができます。

P.緑素吸い声を上げ、細胞にストレスを与え、群がる寒天プレートを画像化するステップを図1に示す。37°CでLB-寒天プレートから2mLのLB-寒天プレートから野生型P.緑素吸着UCBPP-PA14株の単一コロニーを一晩37°Cで接種し、群がる寒天板の中央に5μLを発見した。このプレートのタイムラプスイメージングは、中心にコロニーの形で初期成長を明らかにし、その後、コロニ...

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Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

我々は、平板文書スキャナを用いて、バクテリオファージ(ファージ)および抗生物質ストレスに反応する緑膿菌群の高解像度タイムラプスムービーを生成する簡単な方法を詳述する。この手順は、群れの動態を監視するための迅速かつ簡単な方法であり、他の細菌種の運動性および成長を研究するために適応され得る。

細菌群のタイムラプスイメージングと集団ストレス応答

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

このプロトコルは、シュードモナス緑膿菌群のタイムラプス映画を生成し、バクテリオファージまたは抗生物質による群れの反発を捕捉するために使用することができる。タイムラプス映画は、抗生物質とバクテリオファージに対する群れの反応の詳細なダイナミクスを捉え、この技術は除湿機、コンピュータ、インキュベーター、およびドキュメントスキャナのみを必要とします。P.aeruginosaの群れのタイムラプスイメージングのための群れの寒天プレートを準備するには、25ミリリットルのピペットを使用して、各実験用直径10センチメートルのペトリ皿に20ミリリットルの群れの寒天溶液を加えます。プレートを蓋付きの単一のスタックに室温で1時間置きます。除湿機をオンにして部屋の相対湿度を40~50%に下げ、寒天が固まったら、ふたをオフにして層状のフローフードでさらに30分間乾燥させ、室温で40〜50%の相対湿度で毎分300立方フィートで顔を上げます。その後、乾燥した群れの寒天プレートを摂氏4度で最大24時間保管します。群がる寒天メッキの場合は、一晩のP.aeruginosa培養物から5マイクロリットルを積んだP20ピペットチップを、1つの群れプレートの中心から2〜1/2センチメートル上の10-45度の角度で保持し、プランジャーを液体滴だけで寒天に触れる最初の停止まで落ち込みます。テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。ファージ感染をプレートするには、最初に10倍の10倍の6マイクロリットルを持つ一晩培養P.aeruginoaの30マイクロリットルをファージDMS3 virのミリリットル当たり12個のプラーク形成単位と混合し、すぐに2.8センチメートル半径半径コンコンサークル上の6つの等距離位置にP.aeruginoaファージの6マイクロリットルを加える。テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。抗生物質治療をプレートするには、一晩培養したP.aeruginosaの30マイクロリットルを目的の抗生物質の適切な濃度と体積と混合し、すぐに皿の中心の周りの半径2.8センチメートルの同心円上の6つの等距離衛星位置に抗生物質処理細菌の6マイクロリットルを追加する。テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。すべての文化がメッキされたら、透明なペトリ皿の蓋をカスタムメイドの黒いふたに置き換えます。慎重に10リットルの水浴で摂氏37度に設定されたインキュベーターでスキャナーに群がる寒天プレートを置き、湿度を75%に保ち、プレートをスキャナに入れて保存し、画像の保存パスを設定して保存し、30分間隔でスキャンしてOKをクリックします。画像の取得を自動化するには、スクリプト ソフトウェアを使用します。アイドルスキャンとシングルスキャンの両方を選択し、アイドルスキャンを右クリックして、有効にして左クリックします。インキュベーションの最後に、スキャンした画像をすべて ImageJ にインポートします。シーケンスオプションウィンドウでは、画像の数は選択した画像の数を示します。イメージの最初の画像から開始する 100% で、イメージの元のサイズを節約するために 100% で画像を開始します。画像を色で保つには、RGB に隠しをクリックします。[仮想スタックを使用] をオフのままにし、[OK] をクリックしてイメージを読み込みます。ファイルをクリックし、AVI として保存し、AVI ファイルにイメージをマージします。圧縮を JPEG に、フレーム レートを 1 秒あたり 5 フレームに調整します。次に、AVI のタイムラプスを適切なストレージ フォルダーに保存します。LBスープのLB寒天プレートからの野生型P.aeruginosaの単一コロニーのタイムラプスイメージングは、一晩37度でLBスープの中に発見され、群れの寒天板の中心に発見され、コロニーから放射状に腱に広がるプレートの中心にあるコロニーの形で最初の成長を明らかにする。群れは群がる寒天プレートの中心から周辺に移動し、ファージに感染した細菌またはゲンタマイシンで処理された細菌によって放出されるストレス信号によって撃退される。衛星位置で単独で発見されたファージやゲンタマイシンは、これらの地域を避けるために群れの集団を引き起こしません。25ミリリットルのピペットを使用して、群れの寒天プレートに正確に20ミリリットルが含まれていることを確認してください。また、実験室環境に合わせてプレートの乾燥時間を調整することも重要です。この技術により、緑膿菌集団の全体的な群れのパターンを可視化することができます。次の目的は、ブライトフィールド顕微鏡を用いて個々の細胞運動を監視することです。

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

細菌分裂機械の超解像イメージング

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...