Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

J.-L.B., A.S., 그리고 N.M.H-K. 원고를 작성하고 수정했습니다. 모든 저자는 실험을 설계했다. J.-L.B.는 실험 및 분석을 수행하였다. 이 작품은 NIH 상 K22AI112816 및 R21AI139968 A.S. 및 캘리포니아 대학에 의해 지원되었다. N.M.H-K. Lundbeck 펠로우십 R220-2016-860 및 R251-2017-1070의 지원을 받았습니다. 기금 모금자는 출판을 위해 작품을 제출하기로 결정하는 데 아무런 역할이 없었습니다. 우리는 선언할 경쟁적인 이해관계가 없습니다.

1. P. aeruginosa 떼기 시간 경과 이미징을 위한 떼지어 한천 접시 준비
<ol><li>Na2HPO4•7H2O, KH2PO415 g, NaCl 2.5 g를 500 mL 이중 증류수(ddH2O)에 추가하여 유리 병에 5x M8 최소 용지 1L을 준비합니다. 액체 매체를 살균하고 실온에서 보관하기 위해 추가 ddH2O. Autoclave로 최종 부피를 1L로 조정합니다.</li>
	<li>100 mL의 1M MgSO4 (황산 마그네슘)를 ...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

이 프로토콜은 한천 판의 가변성을 최소화하고 P. aeruginosa 떼지어 스트레스에 대응하는 시간 경과 이미지를 획득하는 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 이 절차는 매체 조성 및 성장 조건을 적응시킴으로써 다른 세균 시스템을 이미지화할 수 있다. P. aeruginosa의경우, M9 또는 FAB 최소 배지가 떼지어16,21을유도하는데 사용될 수?...

떼는 숙주1,,2,,3에서항생제 내성 및 독성 인자의 생산을 증가시키는 조정된 세균 운동성의 집단 형태이다. 이 다세포 행동은 폐에 있는 상피 막을 덮는 점액 층의 그것과 유사한 반 고체 표면에서 생깁니다4,,5. 생체 계면 활성제는 일반적으로 표면의 표면 장력을 극복하기 위해 무리를 지어 생성되며 이들의 생산은 복잡한 세포 세포 신호 시스템, 일컬어 쿼럼 센싱6,,7,,8에의해 조절된다. 많은 종의 박테리아는 녹농균, 황색포도상구균, 대장균9,,10,,11,,12를포함하여 무리를 지을 수 있다. 세균에 의해 생성된 무리 패턴은 다양하고 영양 성분, 다공성 및 수분13,,14를포함하는 표면층의 물리적 및 화학적 특성에 의해 영향을 받습니다. 표면 특성 이외에, 성장 온도 및 주변 습도는 떼지어 속도 및 패턴12,,13,,14,,15를포함하여 무리 역학의 몇몇 양상에 영향을 미칩니다. 무리에 영향을 미치는 성장 변수는 실험 재현성과 결과를 해석하는 능력에 영향을 미치는 문제를 만듭니다. 여기에서는 시간 경과 이미징을 통해 세균 군단의 역학을 모니터링하는 간단한 표준화 방법을 설명합니다. 이 방법은 떼의 진행에 큰 영향을 미치는 중요한 성장 조건을 제어하는 방법을 설명합니다. 전통적인 군단 분석 방법에 비해 이 타임랩스 이미징 방법을 사용하면 오랜 시간 동안 고해상도로 동시에 여러 군단의 운동성을 추적할 수 있습니다. 이러한 측면은 군단 모니터링을 통해 얻을 수 있는 데이터의 깊이를 향상시키고 떼에 영향을 미치는 요인을 쉽게 식별할 수 있습니다.
P. aeruginosa에서 떼이는 주변 지역으로 의 rhamnolipids 및 3-(3-hydroxyalkanoyloxy) 알카노산의 생산 및 방출을 통해 촉진된다6,,16. 파지 바이러스에 의한 항생제 또는 감염의 하위 치명적인 농도에서 스트레스의 도입은 무리의 조직에 영향을 미칩니다. 특히, 이러한 응력은 P. aeruginosa가 쿼럼 감지 분자 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone을 방출하도록 유도하며, 또한 슈도모나스 퀴놀론 신호(PQS)로 알려져있다 17,,18. 두 마리의 무리 집단을 포함하는 군단 의 에서, 응력 유도 인구에 의해 생성된 PQS는 응력포함 지역을 입력하는 처리되지 않은 떼를 격퇴합니다(그림 1). 이 집단 스트레스 대응은 주변 위협에 대해 P. aeruginosa에게 경고하는 위험 통신 신호 시스템을구성18,,19. P. aeruginosa에대한 스트레스의 영향, 집단 스트레스 반응의 활성화 및 군단의 반발은 여기에 설명된 시간 경과 이미징 방법을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 (1) 무리를 위한 한천 플레이트를 준비하고, (2) 배양 P. aeruginosa 두 가지 유형의 분석(전통적인 무리 분석 또는 집단 스트레스 반응 분석)에대해(그림 1), (그림 1),(3) 시간 경과 이미지를 획득하고, (4) ImageJ를 사용하여 이미지를 컴파일하고 분석하는 방법을 설명합니다.
간략하게, P. aeruginosa 하룻밤 문화에서 파지에 감염 되거나 항생제로 치료 하는 P. aeruginosa 위성 위치에서 발견 하는 동안 무리 한천 접시의 중간에 발견 된다. P. aeruginosa 떼의 진행은 습도 조절 37°C 인큐베이터에 배치되는 소비자 문서 평판 스캐너상에서 모니터링됩니다. 스캐너는 일반적으로 16-20 시간 동안 정기적으로 플레이트를 자동으로 스캔하는 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 이 방법은 최대 6 개의 10cm 떼지어 플레이트의 동시 타임 랩스 비디오를 생성합니다. 이미지는 영화로 컴파일되고 스트레스로 인한 모집단에 의한 무리의 반발은 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다. 서로 다른 무리 실험 간의 일관성과 재현성을 보장하기 위해 특별한 고려 사항이 주어집니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

떼는 녹농균과 대장균을포함한 많은 Pseudomonas aeruginosa 세균종에서 관찰되는 표면 운동성의 한 형태이다. 여기에서, 박테리아의 조밀한 인구는 시간의 과정을 통해 특징적인 tendril 모양 지역 사회에 있는 먼 거리에 이동합니다. 떼는 중간 수분, 습도 및 영양소 함량을 포함한 여러 가지 요인에 민감합니다. 또한, 항생제 또는 박테리오파지 (파지)에 의해 스트레스를 받는 P. aeruginosa에서 관찰되는 집단 스트레스 반응은 스트레스가 함유 된 영역에 접근하는 무리를 격퇴합니다. 여기에 설명된 방법은 떼에 영향을 미치는 중요한 요소를 제어하는 방법을 설명합니다. 평판 문서 스캐너를 사용하여 높은 시간적 해상도로 군단역학 및 집단 응력 반응을 모니터링하는 간단한 방법을 소개하고 군단의 정량적 분석을 컴파일하고 수행하는 방법을 설명합니다. 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 무리의 정확하고 잘 제어 된 정량화를 제공하고 플레이트 기반 성장 측정 및 세균 종의 다른 유형으로 확장 될 수있다.

P. aeruginosa를성장시키는 단계는 세포를 강조하고, 떼지어 한천 판을 이미지화하는 단계는 그림 1에나타낸다. 우리는 37 °C에서 LB 국물의 2 mL에서 LB-한천 플레이트에서 야생 형 P. aeruginosa UCBPP-PA14 균주의 단일 콜로니를 접종하고 떼지어 한천 판의 중앙에서 5 μL을 발견했습니다. 이 판의 시간 경과 화상 진찰은 중앙에 있는 식민지의 양식에 있는 초기 성장을 제시하고 그 때...

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Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.

세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

이 프로토콜은 슈도모나스 아에루기노사 떼의 타임랩스 영화를 생산하고 박테리오파지 또는 항생제에 의한 군단의 반발을 포착하는 데 사용할 수 있습니다. 타임랩스 영화는 항생제와 박테리오파지에 대한 무리반응의 상세한 역학을 포착하고 이 기술은 제습기, 컴퓨터, 인큐베이터 및 문서 스캐너만 필요로 합니다. P.aeruginosa 무리 시간 경과 이미징에 대 한 무리 한천 접시를 준비 하려면, 사용 하 여 25 밀리 리터 파이펫 각 실험 10 센티미터 직경 페트리 접시에 무리 한 천용액의 20 밀리리터를 추가.플레이트를 실온에서 1시간 동안 뚜껑이 있는 단일 스택에 놓습니다. 제습기를 켜서 방의 상대 습도를 40-50%로 줄이면 한천이 고화되면, 뚜껑이 꺼진 라미나르 플로우 후드에서 30분 동안 떼지어 온통 천판을 건조하고 실내 온도에서 40-50%의 상대 습도로 분당 300입방피트에서 얼굴을 맞춥니다. 그런 다음 말린 천접시를 섭씨 4도에 최대 24시간 동안 보관합니다.무리한 화나 도금의 경우, 하룻밤 P.aeruginosa 문화에서 5 마이크로리터가 로드된 P20 파이펫 팁을 한 번의 스로밍 플레이트 의 중심 위로 2-1/2 센티미터 의 10-45도 각도로 적재하고 플런저를 액체 방울만 으로 한 채에 닿는 첫 번째 정류장으로 플런저를 누를 피하십시오. 템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다. 파지 감염을 플레이트하기 위해, 먼저 파지 DMS3 vir의 밀리리터 당 12 개의 플라크 형성 단위에 10 의 6 개의 마이크로 리터와 하룻밤 배양 P.aeruginosa의 30 마이크로 리터를 혼합하고 즉시 2.8 센트의 등평성 위성 위치에 P.aeruginosa 파지 혼합물의 6 마이크로 리터를 추가합니다.템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다. 항생제 치료를 플레이트하려면, 하룻밤 배양 P.aeruginosa의 30 마이크로 리터를 관심있는 항생제의 적절한 농도 및 부피와 혼합하고 즉시 접시의 중심에 대한 2.8 센티미터 반경 동심원에 6 개의 등가성 위성 위치에 항생제 처리 된 박테리아의 6 마이크로 리터를 추가합니다. 템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다.모든 문화권이 도금되면 클리어 페트리 접시 뚜껑을 맞춤 제작된 블랙 뚜껑으로 교체하십시오. 스캐너에 플레이트를 놓은 후 75%의 습도를 유지하기 위해 섭씨 37도에 설정된 인큐베이터에 스캐너에 무리한 한천 판을 조심스럽게 배치하여 75%의 습도를 유지한 후, 파일을 열고 설정을 저장하여 이미지에 대한 저장 경로를 설정하고 30분 간격으로 스캔 및 확인을 클릭합니다. 이미지 수집을 자동화하려면 스크립팅 소프트웨어를 사용합니다.유휴 스캔과 단일 스캔을 모두 선택하고 유휴 스캔을 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 활성화된 클릭을 클릭합니다. 인큐베이션이 끝나면 스캔한 모든 이미지를 ImageJ로 가져옵니다. 시퀀스 옵션 창에서 이미지 수는 선택한 이미지 수를 나타냅니다.이미지의 원래 크기를 절약하기 위해 폴더의 첫 번째 그림과 배율 이미지를 100%로 시작하여 이미지를 계속 시작합니다. 이미지를 색상으로 유지하려면 RGB에 은밀한 이미지를 클릭합니다. 가상 스택을 선택 취소 하고 확인을 클릭하여 이미지를 로드합니다.파일을 클릭하고 AVI로 저장하여 이미지를 AVI 파일로 병합합니다. 압축을 JPEG로 조정하고 프레임 속도를 초당 5프레임으로 조정합니다. 그런 다음 AVI 시간 경과를 적절한 저장소 폴더에 저장합니다.LB 국물에 있는 LB 한 천판에서 하룻밤 사이에 37도의 야생식 P.aeruginosa의 단일 식민지의 시간 경과 이미징은 식민지에서 빛나는 텐드릴에 퍼지는 접시의 중심에 있는 식민지의 형태로 초기 성장을 보여줍니다. 군단은 무리 한천 판의 중심에서 주변으로 이동하고 파지에 감염되거나 겐타마이신으로 치료된 박테리아에 의해 방출되는 스트레스 신호에 의해 격퇴됩니다. 위성 위치에서 홀로 발견된 파지 나 겐타마이신은 이 지역을 피하기 위해 인구 떼를 일으키지 않습니다.25 밀리리터 파이펫을 사용하여 무리의 한천 플레이트에 정확히 20밀리리터가 포함되어 있는지 확인합니다. 실험실 환경에 따라 플레이트 건조 시간을 조정하는 것도 중요합니다. 우리의 기술은 우리가 슈도모나스 아루기노사 인구의 전반적인 무리 패턴을 시각화 할 수 있습니다.다음 목표는 브라이트필드 현미경 검사를 사용하여 개별 세포 운동성을 모니터링하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...