Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

J.-L.B., A.S., og N.M.H-K. skrev og reviderte manuskriptet. Alle forfattere designet eksperimentene. J.-L.B. utførte eksperimenter og analyser. Dette arbeidet ble støttet av NIH-prisen K22AI112816 og R21AI139968 stipend til A.S. og ved University of California. N.M.H-K. ble støttet av Lundbeck Fellowships R220-2016-860 og R251-2017-1070. Funders hadde ingen rolle i beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering. Vi har ingen konkurrerende interesser å erklære.

1. Forbereder Svermende Agar Plater for P. aeruginosa Svermende Time-lapse Imaging
<ol><li>Forbered 1 l 5x M8 minimumsmedium i en glassflaske ved å tilsette 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4og 2,5 g NaCl i 500 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O). Juster det endelige volumet til 1 L med ekstra ddH2O. Autoklav for å sterilisere og lagre flytende medier ved romtemperatur.</li>
	<li>Forbered 100 ml 1 M MgSO4 (magnesiumsulfat) i ...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

Denne protokollen fokuserer på å minimere variasjonen i svermende agarplater og gi en enkel og rimelig metode for å skaffe time-lapse bilder av P. aeruginosa svermer og reagerer på stress. Denne prosedyren kan utvides til bilde andre bakterielle systemer ved å tilpasse mediesammensetningen og vekstforholdene. For P. aeruginosa, selv om M9 eller FAB minimalt medium kan brukes til å indusere svermende16,21, protokollen som presenteres her br...

Swarming er en kollektiv form for koordinert bakteriell motilitet som øker antibiotikaresistens og produksjon av virulens faktorer i verten1,2,3. Denne flercellulære oppførselen oppstår på halvfaste overflater som ligner de av slimete lag som dekker epitelmembraner i lungene4,5. Biosurfactants er ofte produsert av svermende populasjoner for å overvinne overflatespenningen på overflater og produksjonen av disse er regulert av komplekse celle-celle signalsystemer, også kjent som quorum sensing6,7,8. Mange arter av bakterier er i stand til å sverme, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, og Escherichia coli9,10,11,12. De svermende mønstreskapt av bakterier er forskjellige og påvirkes av de fysiske og kjemiske egenskapene til overflatelaget, inkludert næringssammensetning, porøsitet og fuktighet13,14. I tillegg til overflateegenskaper påvirker veksttemperatur og omgivelsesfuktighet flere aspekter ved svermende dynamikk, inkludert svermende hastighet og mønstre12,,13,,14,15. Vekstvariablene som påvirker svermen skaper utfordringer som påvirker eksperimentell reproduserbarhet og evnen til å tolke resultater. Her beskriver vi en enkel standardisert metode for å overvåke dynamikken i bakterielle svermer gjennom tidsforløpsavbildning. Metoden beskriver hvordan man kontrollerer kritiske vekstforhold som i betydelig grad påvirker progresjonen av svermende. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for svermanalyse, gjør denne tidsforløpsmetoden det mulig å spore motiliteten til flere svermer samtidig i lengre perioder og med høy oppløsning. Disse aspektene forbedrer dybden av data som kan oppnås ved å overvåke svermer og lette identifisering av faktorer som påvirker oppvarming.
Svermip aeruginosa er tilrettelagt gjennom produksjon og frigjøring av rhamnolipider og 3-(3-hydroksyalkanoyloksy) alkanosyrer inn i området6,16. Innføringen av stress fra sub-dødelige konsentrasjoner av antibiotika eller infeksjon ved phage virus påvirker organiseringen av svermer. Spesielt induserer disse påkjenningene P. aeruginosa for å frigjøre quorumet sensing molekyl 2-heptyl-3-hydroksy-4-quinolon, også kjent som Pseudomonas kinoolon signal (PQS)17,18. I svermanalyser som inneholder to populasjoner av svermer, avviser PQS produsert av den stressinduserte populasjonen ubehandlede svermer fra å komme inn i området som inneholder stresset (figur 1). Denne kollektive stressresponsen utgjør et farekommunikasjonssignalsystem som advarer P. aeruginosa om trusler i nærheten18,19. Effekten av stress på P. aeruginosa, aktiveringen av den kollektive stressresponsen, og frastøtelsen av svermer kan visualiseres ved hjelp av tidsforløpsbildemetoden som er beskrevet her. Protokollen som er beskrevet her forklarer hvordan: (1) forberede agar plater for sverming, (2) kultur P. aeruginosa for to typer analyser (tradisjonelle svermende analyser eller kollektiv stress respons analyser) (Figur 1), (3) skaffe time-lapse bilder, og (4) bruke ImageJ til å kompilere og analysere bildene.
Kort, P. aeruginosa fra en overnatting kultur er oppdaget midt i en svermende agar plate mens P. aeruginosa som er smittet med phage eller behandlet med antibiotika er oppdaget på satellittstillinger. Progresjonen av P. aeruginosa svermer overvåkes på en forbruker dokument planskanner som er plassert i en fuktighetsregulert 37 °C inkubator. Skanneren styres av en programvare som automatisk skanner platene med jevne mellomrom over den svermvekstperioden, vanligvis 16–20 timer. Denne metoden gir samtidige time-lapse videoer på opptil seks 10 cm svermende plater. Bildene er kompilert i filmer og frastøting av svermer av stress-indusert populasjoner er kvantifisert ved hjelp av fritt tilgjengelig ImageJ programvare. Det tas særlig hensyn for å sikre konsistens og reproduserbarhet mellom ulike svermende eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

Swarming er en form for overflate motilitet observert i mange bakterielle arter, inkludert Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli. Her beveger tette bestander av bakterier seg over store avstander i karakteristiske tendrilformede samfunn i løpet av timer. Svermer er følsomt for flere faktorer, inkludert middels fuktighet, fuktighet og næringsinnhold. I tillegg avviser den kollektive stressresponsen, som observeres i P. aeruginosa som er stresset av antibiotika eller bakteriofan (phage), svermer fra å nærme seg området som inneholder stresset. Metodene som er beskrevet her, tar for seg hvordan man kontrollerer de kritiske faktorene som påvirker oppvarmingen. Vi introduserer en enkel metode for å overvåke svermende dynamikk og den kollektive stressresponsen med høy timelig oppløsning ved hjelp av en plandokumentskanner, og beskriver hvordan man kompilerer og utfører en kvantitativ analyse av svermer. Denne enkle og kostnadseffektive metoden gir presis og velkontrollert kvantifisering av svermer og kan utvides til andre typer platebaserte vekstanalyser og bakterielle arter.

Trinnene for å vokse P. aeruginosa, stresscellene, og bilde de svermende agar platene er representert i figur 1. Vi inokulerte en enkelt koloni av villtype P. aeruginosa UCBPP-PA14 stamme fra en LB-agar plate i 2 ml LB kjøttkraft over natten på 37 ° C og oppdaget 5 μL i midten av svermende agar plate. Time-lapse imaging av denne platen avslører innledende vekst i form av en koloni i sentrum og deretter spredning av tendrils radially fra kolonien (Video 1). For kol...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Vi beskriver en enkel metode for å produsere høyoppløselige time-lapse filmer av Pseudomonas aeruginosa svermer som reagerer på bakteriofan (phage) og antibiotika stress ved hjelp av en plandokument skanner. Denne prosedyren er en rask og enkel metode for overvåking av svermende dynamikk og kan tilpasses for å studere motilitet og vekst av andre bakterielle arter.

Time-lapse Imaging av bakterielle svermer og kollektiv stressrespons

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Denne protokollen kan brukes til å produsere time-lapse filmer av Pseudomonas aeruginosa swarming og for å fange frastøtelse av sverm av bakteriofage eller antibiotika. De tidsforløpende filmene fanger opp den detaljerte dynamikken i den svermende responsen på antibiotika og bakteriofage, og teknikken krever bare en avfukter, datamaskin, inkubator og dokumentskanner. For å forberede svermende agarplater for P.aeruginosa svermende time-lapse imaging, bruk en 25 milliliter pipette for å legge til 20 milliliter svermende agarløsning til hver eksperimentelle 10 centimeter diameter Petriskål.Legg platene i en enkelt stabel med lokk i en time ved romtemperatur. Slå på en avfukter for å redusere den relative fuktigheten i rommet til 40-50%Når agaren har størknet, tørk de svermende agarplatene i ytterligere 30 minutter i en laminær strømningshette med lokkene av og med forsiden opp på 300 kubikkfot per minutt med en 40-50% relativ fuktighet ved romtemperatur. Oppbevar deretter de tørkede svermende agarplatene ved fire grader Celsius i opptil 24 timer.For svermende agarplating, hold en P20 pipettespiss lastet med fem mikroliter fra en overnatting p.aeruginosa kultur i en 10-45 graders vinkel 2-1/2 centimeter over midten av en svermende plate og trykk stempelet til første stopp berøre agaren med bare væskedråpen. Bruk en mal til å plassere stedet konsekvent på tvers av de forskjellige svermende agarplatene. For å plate en phage infeksjon, først blande 30 mikroliter av natten kultivert P.aeruginosa med seks mikroliter av en gang 10 til 12 plakkdannende enheter per milliliter phage DMS3 vir og umiddelbart legge til seks mikroliter av P.aeruginosa phage blanding på seks likedistant satellittposisjoner på en 2,8 centimeter radius konsentrisk sirkel som demonstrert.Bruk en mal til å plassere stedet konsekvent på tvers av forskjellige svermende agarplater. For å plate antibiotika behandlinger, bland 30 mikroliter av natten kultivert P.aeruginosa med riktig konsentrasjon og volum av antibiotika av interesse og umiddelbart legge seks mikroliter av antibiotika-behandlet bakterier på seks likedistant satellittposisjoner på en 2,8 centimeter radius konsentrisk sirkel om midten av parabolen. Bruk en mal til å plassere stedet konsekvent på tvers av de forskjellige svermende agarplatene.Når alle kulturene er belagt, må du erstatte de klare petriskållokkene med skreddersydde svarte lokk. Plasser forsiktig de svermende agarplatene på en skanner i en inkubator satt til 37 grader Celsius med et 10 liters vannbad for å opprettholde fuktigheten på 75%Etter å ha plassert platene i skanneren, åpne filen og lagre innstillinger for å angi sparebanen for bildene og klikk på skanning og OK med 30-minutters intervaller. Hvis du vil automatisere bildeanskaffelsen, bruker du skriptprogramvaren.Velg både inaktiv skanning og enkelt skanning og høyreklikk på inaktiv skanning, og deretter venstreklikk på aktivert. På slutten av inkubasjonen importerer du alle de skannede bildene til ImageJ. I vinduet sekvensalternativer angir antall bilder antall valgte bilder.Fortsett å starte bildet på ett for å starte fra det første bildet i mappen og skaleringsbildene på 100%for å bevare den opprinnelige størrelsen på bildene. Klikk skjult til RGB for å holde bildene i farger. La bruk virtuell stabel være ukontrollert og klikk OK for å laste bildene.Klikk fil, lagre som og AVI for å slå sammen bildene til en AVI-fil. Juster komprimeringen til JPEG og bildefrekvensen til fem bilder per sekund. Lagre deretter AVI-tidsforløpet i riktig lagringsmappe.Time-lapse imaging av en enkelt koloni av vill-type P.aeruginosa fra en LB agar plate i LB kjøttkraft over natten på 37 grader Celsius og oppdaget inn i sentrum av en svermende agar plate avslører en innledende vekst i form av en koloni i midten av platen som sprer seg i tendrils radialt fra kolonien. Svermer beveger seg fra midten av de svermende agarplatene til periferien og frastøtes av et stresssignal som slippes ut av bakteriene som ble smittet med phages eller behandlet med Gentamycin. Phages eller Gentamycin oppdaget alene på satellittposisjoner ikke føre til svermende populasjoner for å unngå disse områdene.Bruk en 25 milliliter pipette for å sikre at de svermende agarplatene inneholder nøyaktig 20 milliliter. Det er også viktig å justere tørketiden på platen i henhold til laboratoriemiljøet. Vår teknikk gjør det mulig for oss å visualisere de generelle svermende mønstrene til Pseudomonas aeruginosa populasjoner.Det neste målet er å overvåke individuell cellemotilitet ved hjelp av Brightfield mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsiktig, høy oppløsning Confocal Time Lapse Imaging av<em&gt; Arabidopsis cotyledon</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-oppløsning Imaging av Bakteriell divisjon Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av Kraniofacial Development i sox10: kaede Transgenic Sebrafisk linjen ved hjelp av Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...