Name: time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

J.-L.B., A.S., e N.M.H-K. escreveu e revisou o manuscrito. Todos os autores projetaram os experimentos. J.-L.B. realizou os experimentos e análises. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio NIH K22AI112816 e R21AI139968 bolsa para a A.S. e pela Universidade da Califórnia. N.M.H-K. foi apoiado pela Lundbeck Fellowships R220-2016-860 e R251-2017-1070. Os financiadores não tiveram papel na decisão de submeter o trabalho à publicação. Não temos interesses concorrentes para declarar.

1. Preparando placas de ágar de enxame para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
<ol><li>Prepare 1 L de mídia mínima 5x M8 em uma garrafa de vidro adicionando 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4, e 2,5 g de NaCl em 500 mL de água dupla destilada (ddH2O). Ajuste o volume final para 1 L com ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar e armazenar mídia líquida à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 100 mL de 1 M MgSO<su...

<ol>
	<li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics.">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li><li>Lai, S., Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+motility:+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance.">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li><li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li><li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators,+including+MetR.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li><li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium.">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>D&#233;ziel, E., L&#233;pine, F., Milot, S., Villemur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rhlA+is+required+for+the+production+of+a+novel+biosurfactant+promoting+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa:+3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic+acids+(HAAs),+the+precursors+of+rhamnolipids.">rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids.</a> Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).</li><li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production.">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology &amp; Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li><li>K&#246;hler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pech&#232;re, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili.">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li><li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility.">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698 (2015).</li><li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotaxis+system,+but+not+chemotaxis,+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli.">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+imaging,+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays.">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).</li><li>Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. -. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms.">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li><li>Bru, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics.">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PQS+signaling+for+more+than+a+quorum:+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations.">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li><li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888 (2011).</li><li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming.">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li><li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait.">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).</li><li>Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling.">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li></ol>

Este protocolo se concentra em minimizar a variabilidade no enxame de placas de ágar e fornecer um método simples e de baixo custo para adquirir imagens de lapso de tempo de P. aeruginosa e responder ao estresse. Este procedimento pode ser estendido à imagem de outros sistemas bacterianos, adaptando a composição da mídia e as condições de crescimento. Para P. aeruginosa,embora m9 ou fab médio mínimo possa ser usado para induzir o enxame16,21...

Swarming é uma forma coletiva de motilidade bacteriana coordenada que aumenta a resistência a antibióticos e a produção de fatores de virulência no hospedeiro1,2,3. Esse comportamento multicelular ocorre em superfícies semi-sólidas que se assemelham às das camadas mucosas que cobrem membranas epiteliais nos pulmões4,5. Os biosurfactantes são comumente produzidos por populações de enxame para superar a tensão superficial nas superfícies e a produção destes é regulada por sistemas complexos de sinalização celular-célula, também conhecidos como detecção de quórum6,7,8. Muitas espécies de bactérias são capazes de enxame, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Escherichia coli9,10,11,12. Os padrões de enxame criados pelas bactérias são diversos e são afetados pelas propriedades físicas e químicas da camada superficial, incluindo composição de nutrientes, porosidade e umidade13,14. Além das propriedades superficiais, a temperatura de crescimento e a umidade ambiente afetam vários aspectos da dinâmica do enxame, incluindo a taxa de enxame e os padrões12,,13,,14,15. As variáveis de crescimento que afetam o enxame criam desafios que impactam a reprodutibilidade experimental e a capacidade de interpretar resultados. Aqui, descrevemos um método padronizado simples para monitorar a dinâmica dos enxames bacterianos através de imagens de lapso de tempo. O método descreve como controlar condições críticas de crescimento que afetam significativamente a progressão do enxame. Comparado com os métodos tradicionais de análise de enxames, este método de imagem de lapso de tempo permite rastrear a motilidade de múltiplos enxames simultaneamente durante longos períodos de tempo e com alta resolução. Esses aspectos melhoram a profundidade dos dados que podem ser obtidos a partir do monitoramento de enxames e facilitam a identificação de fatores que afetam o enxame.
O enxame em P. aeruginosa é facilitado através da produção e liberação de rhamnolipids e ácidos alcalinoicos 3-(3-hidroxialnoyloxy)na área circundante6,16. A introdução de estresse a partir de concentrações subletais de antibióticos ou infecção pelo vírus phage impacta a organização de enxames. Em particular, essas tensões induzem p. aeruginosa a liberar a molécula de detecção de quórum 2-heptyl-3-hidroxi-4-quinolone, também conhecida como sinal de quinolone pseudomonas (PQS)17,18. Em ensaios de enxame que contêm duas populações de enxames, o PQS produzido pela população induzida pelo estresse repele enxames não tratados de entrar na área que contém o estresse (Figura 1). Esta resposta coletiva de estresse constitui um sistema de sinalização de comunicação de perigo que alerta P. aeruginosa sobre ameaças próximas18,19. Os efeitos do estresse em P. aeruginosa,a ativação da resposta ao estresse coletivo e a repulsa dos enxames podem ser visualizados usando o método de imagem de lapso de tempo descrito aqui. O protocolo descrito aqui explica como: (1) preparar placas de ágar para enxame, (2) cultura P. aeruginosa para dois tipos de ensaios (ensaios tradicionais de enxame ou ensaios de resposta ao estresse coletivo) (Figura 1), (3) adquirir imagens de lapso de tempo, e (4) usar ImageJ para compilar e analisar as imagens.
Resumidamente, P. aeruginosa de uma cultura noturna é vista no meio de uma placa de ágar, enquanto P. aeruginosa que são infectados com phage ou tratados com antibióticos são vistos nas posições do satélite. A progressão do enxame de P. aeruginosa é monitorada em um scanner de fundo de documento de consumo que é colocado em uma incubadora de 37 °C regulada pela umidade. O scanner é controlado por um software que verifica automaticamente as placas em intervalos regulares durante o período de crescimento do enxame, tipicamente de 16 a 20 h. Este método produz vídeos de lapso de tempo simultâneos de até seis placas de enxame de 10 cm. As imagens são compiladas em filmes e a repulsa de enxames por populações induzidas pelo estresse é quantificada usando o software ImageJ livremente disponível. Considerações especiais são dadas para garantir consistência e reprodutibilidade entre diferentes experimentos de enxame.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:844px;" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reagents</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">214010</td>
			<td>For LB-agar plate and swarming agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">223050</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">D16500</td>
			<td>Dextrose. For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:228px;">Fosfomycin disodium salt</td>
			<td style="width:157px;">Tokyo Chemical Industry</td>
			<td style="width:120px;">F0889</td>
			<td>Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1914</td>
			<td>Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:228px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">60615</td>
			<td>Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:157px;">BD Difco</td>
			<td style="width:120px;">244620</td>
			<td>For LB broth and LB-agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">230391</td>
			<td>For swarming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0662</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S9888</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:120px;">S373</td>
			<td>For 5X M8 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Strains</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:157px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:120px;">AFS27E.118</td>
			<td>PA14 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DMS3vir</td>
			<td style="width:157px;">O&#39;Toole lab</td>
			<td style="width:120px;">DMS3vir20</td>
			<td>Bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Supplies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminium oxide sandpaper</td>
			<td style="width:157px;">3M</td>
			<td style="width:120px;">150 Fine</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black fabric</td>
			<td style="width:157px;">Joann</td>
			<td style="width:120px;">PRD7089</td>
			<td>Black fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Black spray paint</td>
			<td style="width:157px;">Krylon</td>
			<td style="width:120px;">5592 Matte Black</td>
			<td>For black lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:157px;">Kimax</td>
			<td style="width:120px;">26500</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:157px;">Pyrex</td>
			<td style="width:120px;">13951L</td>
			<td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">8 inches zip ties</td>
			<td style="width:157px;">Gardner Bender</td>
			<td style="width:120px;">E173770</td>
			<td>For attaching black matte fabric</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Petri dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">FB0875712</td>
			<td>100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">23-400-102</td>
			<td>For streaking and inoculating bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Autoclave</td>
			<td style="width:157px;">Market Forge Industries</td>
			<td style="width:120px;">STM-E</td>
			<td>For sterilizing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">25 mL pipette</td>
			<td style="width:157px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">1072-5410</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:157px;">Frigidaire</td>
			<td style="width:120px;">FAD704DWD 70-pint</td>
			<td>For maintaing room relative humidity at about 45%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">ImageJ</td>
			<td style="width:157px;">NIH</td>
			<td style="width:120px;">v1.52a</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Incubator</td>
			<td style="width:157px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">89032-092</td>
			<td>For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Isotemp waterbath</td>
			<td style="width:157px;">Fisher</td>
			<td style="width:120px;">15-462-21Q</td>
			<td>For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:157px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:120px;">SG603A</td>
			<td>For drying plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">P-20 pipet</td>
			<td style="width:157px;">Gilson</td>
			<td style="width:120px;">F123601</td>
			<td>Spotting on swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Pipette Controller</td>
			<td style="width:157px;">BrandTech</td>
			<td style="width:120px;">accu-jet</td>
			<td>To pipet 20 mL for swarming agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Roller Drum</td>
			<td style="width:157px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:120px;">TC-7</td>
			<td>For growth of bacteria at 100 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">Epson Perfection V370 Photo</td>
			<td>Scanner for imaging plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Scanner automation software</td>
			<td style="width:157px;">RoboTask Lite</td>
			<td style="width:120px;">v7.0.1.932</td>
			<td>For 30-min internals imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Scanner image acquisition software</td>
			<td style="width:157px;">Epson</td>
			<td style="width:120px;">v9.9.2.5US</td>
			<td>Software for imaging plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response

Swarming é uma forma de motilidade superficial observada em muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Aqui, populações densas de bactérias se movem por grandes distâncias em comunidades características em forma de tendril ao longo das horas. O enxame é sensível a vários fatores, incluindo umidade média, umidade e teor de nutrientes. Além disso, a resposta ao estresse coletivo, observada em P. aeruginosa que são estressadas por antibióticos ou bacteriófagos (phage), repele enxames de aproximação da área que contém o estresse. Os métodos descritos aqui abordam como controlar os fatores críticos que afetam o enxame. Introduzimos um método simples para monitorar a dinâmica do enxame e a resposta ao estresse coletivo com alta resolução temporal usando um scanner de documentos de leito, e descrevemos como compilar e realizar uma análise quantitativa de enxames. Este método simples e econômico fornece quantificação precisa e bem controlada do enxame e pode ser estendido a outros tipos de ensaios de crescimento baseados em placas e espécies bacterianas.

Os passos para o crescimento de P. aeruginosa,estresse as células e imagem as placas de ágar enxame estão representados na Figura 1. Inoculamos uma única colônia de cepa de P. aeruginosa UCBPP-PA14 do tipo LB-ágar em 2 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C e avistamos 5 μL no centro da placa de ágar. A imagem de lapso de tempo desta placa revela o crescimento inicial na forma de uma colônia no centro e, em seguida, a propagação de tendões radialmente da colônia(V?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Detalhamos um método simples para produzir filmes de lapso de tempo de alta resolução de enxames pseudomonas aeruginosa que respondem a bacteriófagos (phage) e estresse antibiótico usando um scanner de documentos de leito. Este procedimento é um método rápido e simples de monitoramento da dinâmica do enxame e pode ser adaptado para estudar a motilidade e o crescimento de outras espécies bacterianas.

Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Este protocolo pode ser usado para produzir filmes de lapso de tempo de Pseudomonas aeruginosa swarming e para capturar a repulsão de enxame por bacteriófago ou antibióticos. Os filmes de lapso de tempo capturam a dinâmica detalhada da resposta a antibióticos e bacteriófagos e a técnica requer apenas um desumidificador, computador, incubadora e scanner de documentos. Para preparar placas de ágar para imagens de lapso de tempo de P.aeruginosa, use uma pipeta de 25 mililitros para adicionar 20 mililitros de solução de ágar a cada placa experimental de 10 centímetros de diâmetro de Petri.Coloque as placas em uma única pilha com tampas durante uma hora em temperatura ambiente. Ligue um desumidificador para diminuir a umidade relativa da sala para 40-50%Quando o ágar se solidificar, seque as placas de ágar por mais 30 minutos em um capô de fluxo laminar com as tampas desligadas e encare a 300 pés cúbicos por minuto com uma umidade relativa de 40-50% à temperatura ambiente. Em seguida, armazene as placas secas de ágar a quatro graus Celsius por até 24 horas.Para emplacar ágar swarming, segure uma ponta de pipeta P20 carregada com cinco microliters de uma cultura P.aeruginosa durante a noite em um ângulo de 10-45 graus 2-1/2 centímetros acima do centro de uma placa de enxame e deprimir o êmbolo para a primeira parada tocando o ágar com apenas a gota líquida. Use um modelo para posicionar o local consistentemente entre as diferentes placas de ágar. Para emplacar uma infecção por phage, misture primeiro 30 microlitadores de P.aeruginosa cultivados durante a noite com seis microlitadores de uma vez 10 para as 12 unidades formadoras de placas por mililitro de phage DMS3 vir e adicione imediatamente seis microliters da mistura de phage P.aeruginosa em seis posições satélites equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 centímetros como demonstrado.Use um modelo para posicionar o local consistentemente em diferentes placas de ágar. Para aplacar os tratamentos com antibióticos, misture 30 microlitadores de P.aeruginosa cultivados durante a noite com a concentração e o volume apropriados do antibiótico de interesse e adicione imediatamente seis microliters da bactéria tratada com antibióticos em seis posições de satélite equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 centímetros sobre o centro da antena. Use um modelo para posicionar o local consistentemente entre as diferentes placas de ágar.Quando todas as culturas tiverem sido banhadas, substitua as tampas claras da placa de Petri por tampas pretas personalizadas. Coloque cuidadosamente as placas de ágar em um scanner em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius com um banho de água de 10 litros para manter a umidade em 75% Depois de colocar as placas no scanner, abra o arquivo e salve as configurações para definir o caminho de salvamento para as imagens e clique em digitalizar e OK em intervalos de 30 minutos. Para automatizar a aquisição de imagens, use o software de scripting.Selecione a varredura ociosa e a varredura única e clique à direita na varredura ociosa e, em seguida, clique à esquerda ativado. No final da incubação, importe todas as imagens digitalizadas para ImageJ. Na janela de opções de sequência, o número de imagens indicará o número de imagens selecionadas.Mantenha a imagem inicial em uma para começar a partir da primeira imagem na pasta e as imagens de escala em 100% para conservar o tamanho original das imagens. Clique em capa para RGB para manter as imagens em cores. Deixe usar pilha virtual sem controle e clique em OK para carregar as imagens.Clique em arquivo, salve como e AVI para mesclar as imagens em um arquivo AVI. Ajuste a compressão para JPEG e a taxa de quadros para cinco quadros por segundo. Em seguida, salve o lapso de tempo da AVI na pasta de armazenamento apropriada.Imagens de lapso de tempo de uma única colônia de P.aeruginosa tipo selvagem de uma placa de ágar LB em caldo LB durante a noite a 37 graus Celsius e avistadas no centro de uma placa de ágar infestada revela um crescimento inicial na forma de uma colônia no centro da placa que se espalha em tendrils radialmente da colônia. Enxames se movem do centro das placas de ágar para a periferia e são repelidos por um sinal de estresse emitido pelas bactérias que foram infectadas com phages ou tratadas com Gentamicina. Phages ou Gentamicina vistas sozinhas nas posições de satélite não fazem com que populações em chamas evitem essas áreas.Use uma pipeta de 25 mililitros para garantir que as placas de ágar infestadas contenham exatamente 20 mililitros. Também é importante ajustar o tempo de secagem da placa de acordo com o ambiente laboratorial. Nossa técnica nos permite visualizar os padrões globais de enxame das populações pseudomonas aeruginosa.O próximo objetivo é monitorar a motilidade celular individual usando microscopia Brightfield.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...