Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

Vi takker J. Birchler, E. Bach og Bloomington Drosophila Stock Center for forskellige Drosophila stammer; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for Onkologi Set små-molekyle stof bibliotek; UCSD bachelorstuderende, herunder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza og Alex Chavez. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af et forskningstilskud fra American Thoracic Society til J.L. og finansiering fra NIH: R01GM131044 til W.X.L.

1. Drug bibliotek forberedelse
<ol><li>Identificer og forbered et lægemiddelbibliotek, der skal screenes med passende opløsningsmiddel ved den ønskede koncentration (f.eks. 10 mM i DMSO). BEMÆRK: Et specifikt eksempel for et lægemiddel bibliotek er Onkologi Set III fra National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Forbindelser i dette sæt leveres som 20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i to 96-brønd PP U-bundplader og opbevares ved -20 °C. NCI Plate kort, og de grundlæggende kemiske dat...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function.">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li><li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression.">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer.">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li><li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin:+Guardian+of+the+Genome.">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing.">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth.">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li></ol>

Heterochromatin er en kondenseret form for DNA, der spiller en central rolle i reguleringen af genekspression. Det bliver stadig mere anerkendt i kræft og kan tjene som et potentielt mål for kræftbehandling15,16,17,18. Små molekyle forbindelser er almindeligt anvendt i udviklingen af lægemidler på grund af fordele i fremstilling, konservering, og stofskifte i menneskelige kroppe. For at i...

Heterochromatin er en kondenseret form for DNA, der spiller en central rolle i genekspression, i reguleringen kromosom adskillelse under celledeling, og i at beskytte mod genom ustabilitet1. Heterochromatin anses for at være en genundertrykkelsesregulator og for at beskytte kromosomintegriteten under cellemitose2,3. Det er forbundet med di- og tri-methylering af histon H3 lysin 9 (H3K9me) under afstamning engagement4,5. Desuden anses rekruttering af heterokratinprotein 1 (HP1) chromodomain proteiner også for at være forbundet med heterochromatin og epigenetisk undertrykkelse af genekspression6. Disse proteiner er væsentlige komponenter og markører for heterochromatin dannelse.
Da genomisk ustabilitet gør det muligt for celler at erhverve genetiske ændringer, der fremmer carcinogenese, heterochromatin bliver mere anerkendt i kræftudvikling og kan målrettes til kræftbehandling7,8. I øjeblikket er der ingen lægemidler, der er veletablerede i at bistå heterochromatin dannelse. Her præsenterer vi en enkel og hurtig, men effektiv metode til screening af små molekyleforbindelser, der fremmer heterochromatindannelse. Screeningen sker ved at behandle Drosophila med et bibliotek af små-molekyle medicin. Denne metode udnytter en broget øjenfarve fænotype i DX1Drosophila stamme, der er påvirket af heterochromatin niveauer. DX1 fluer indeholder en tandem vifte af syv P [lac-w] transgenes, som har den brogede udtryk / depression afhængigt af heterochromatinization, derfor omfanget af variegation i øjenfarven afspejler heterochromatin niveau. Specifikt, stigende heterochromatin kunne påvises ved den stigende andel af brogede øjenfarve (hvide øjne). Tværtimod vil faldende heterochromatin blive påvist ved den stigende andel af P[lac-w] transgene ekspressionen (røde øjne)9,10,11,12.
Derfor udnytter vi dette Drosophila transgene system, der producerer en broget øjenfarve fænotype, da dens udtryk er direkte korreleret med mængden af heterochromatin til stede. Ved opdagelsen af forbindelser, der mistænkes for at fremme heterochromatin dannelse, Vi kan bekræfte denne mistanke ved hjælp af andre metoder såsom vestlige blot. Disse heterochromatinfremmende stoffer kan videreudvikles til kliniske forsøg med patienter i fremtiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Drosophila er en fremragende model organisme, der kan bruges til at screene forbindelser, der kan være nyttige for kræftbehandling. Den metode, der er beskrevet her, er en omkostningseffektiv in vivo-metode til at identificere heterochromatinfremmende forbindelser ved hjælp af Drosophila. Den Drosophila's DX1 stamme, der har en broget øjenfarve fænotype, der afspejler omfanget af heterochromatin dannelse, hvilket giver et værktøj til en heterochromatin-fremmende stof skærm. I denne screeningmetode kvantificeres øjenvariegationen baseret på overfladearealet af rød pigmentering, der besætter dele af øjet og scores på en skala fra 1 til 5. Screeningsmetoden er ligetil og følsom og giver mulighed for at teste forbindelser in vivo. Drug screening ved hjælp af denne metode giver en hurtig og billig måde at identificere heterochromatin-fremme lægemidler, der kunne have gavnlige virkninger i kræft terapeutiske. Identifikation af forbindelser, der fremmer dannelsen af heterochromatin kan også føre til opdagelsen af epigenetiske mekanismer for kræft udvikling.

Denne protokol blev med succes brugt til at screene forbindelser, der fremmer heterochromatindannelse i Drosophila, som er et effektivt og billigt in vivo-system til udvikling af lægemidler (figur 1). Vi screenet en lille molekyle stof bibliotek, Oncology Set III, som er sammensat af 97 FDA autoriserede onkologi medicin, ved hjælp af DX1 stamme af Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultaterne for et signifikant l?...

Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila er en udbredt eksperimentel model egnet til screening narkotika med potentielle ansøgninger om kræftbehandling. Her beskriver vi brugen af Drosophila brogede øjenfarvefænotyper som en metode til screening af små molekyleforbindelser, der fremmer heterochromatindannelse.

En screeningmetode til identifikation af heterokratinfremmende stoffer ved hjælp af Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

I øjeblikket er der ingen lægemidler, der er veletablerede i at fremme heterochromatin dannelse. Her præsenterer vi en enkel og effektiv metode til at identificere små molekyleforbindelser, der fremmer denne proces. Vores screening protokol giver en enkel, billig, let at følge in vivo system til heterochromatin-fremme narkotika identifikation.Identifikation af forbindelser, der fremmer heterochromatin dannelse kan føre til opdagelsen af mekanismer af kræft, at reparere og kræftbehandling. Denne omkostningseffektive er blevet målt til at identificere heterochromatin-fremmende forbindelser i Drosophila kunne også bruges til at tælle form hits, da det er en forebyggende foranstaltning til en højeste celle pulje af celle screening. Vores screening protokol kunne også være nyttigt for hurtig pilot skærme som denne Drosophila TranSheet system producerer en broget øjenfarve fænotype, der er omvendt korreleret til mængden af heterochromatin til stede i fluen.Hjælpe med at demonstrere proceduren vil være Kenny Dao, en undergrad studerende fra vores laboratorium. Efter at have identificeret og forberedt et lægemiddel bibliotek til en screening ved hjælp af en passende opløsningsmiddel, og den ønskede koncentration, krydse tre mandlige fluer med tre eller flere jomfru kvindelige fluer i en 25 af 95 millimeter mad hætteglas. Med ni millimeter standard Drosophila mad medium.Opret tre replika hætteglas for hvert stof. Tilføj et kontrolhætteglas til skærmen. Og lad fluerne lægge æg i to dage ved stuetemperatur.På korsets dag to bedøves fluerne med en kort eksplosion af kuldioxid. Og kassér forældrene flyver i en flaske, der indeholder 70% ethanol. Dernæst fortyndes hvert lægemiddel stof fra den oprindelige bestand til at deltage mikro molar endelige koncentration i 33% DMSO i vand.Og tilføje 60 mikroliter af stoffet, eller kontrol 33% DMSO alene, på toppen af fluemad. Derefter bekræfte, at ingen forældre fluer er til stede i hætteglas. Og tilføje lægemidlet løsning til de relevante hætteglas.To dage efter F1-fluerne opstår, overføres bedøvede fluer fra et hætteglas ad gangen på en porøs dissekerepude med kuldioxidfiltrering igennem under filterpapiret. Under en dissekere mikroskop, undersøge hver hele flue, identificere alle de heterozygode mænd ved deres mangel på krøllet o-dominerende krøllet fløj fænotype. Score øjenfarven af hver heterozygot mandlige på en skala fra en til fem.Med en en score tildeles til en mindre end 5% rød spredt øje samlede overfladeareal. Tilføj en to score til fluer med en 6 til 25% rød plet øje samlede overfladeareal. En tre til fluer med en 26 til 50% rød plet øje samlede overfladeareal.En fire til fluer med en 51 til 75% rød plet øje samlede overfladeareal. Og en fem fluer med en mere end 75% rød plet øje samlede overfladeareal. Derefter beregne den gennemsnitlige farve indeks for alle hannerne fra hvert hætteglas scoret i tre eksemplarer.For at bekræfte, at forbindelserne faktisk fremme heterochromatin dannelse, en anden validering teknik, såsom vestlige blotting, kan udføres. I denne repræsentative eksperiment, et lille molekyle stof bibliotek, onkologi sæt 3, som er sammensat af 97 FDA godkendt onkologi narkotika, blev screenet ved hjælp af DX1 stamme af Drosophila Melanogaster. Ifølge screening assay, methotrexat, kodet som E7 i biblioteket, forårsagede den mest variation inden for Dx1 stamme.Tyder på, at methotrexat kunne være den mest lovende heterochromatin-fremme lægemiddel til fremtidig kræft målrettet behandling. For yderligere at bekræfte, at dette stof fremmer heterochromatin transformation, vestlige blot data blev udført. Demonstration af op regulering af heterochromatin formatin associeret protein, H3K9 trimethylering, og validering af screeningresultater.Det kritiske skridt er scoring øjenfarven af hver af de hvide 11-18 DX1 heterozygot mandlige fluer på en skala fra en til fem i henhold til en forudbestemt undersøgelse rute. Vi kan bruge vestlige blots eller immunostaining at bekræfte hits. Opdagelsen af forbindelser, der mistænkes for at fremme heterochromatin dannelse kan også føre til opdagelsen af IV genetiske mekanisme af kræft udvikling og kliniske forsøg hos humane patienter.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion og identifikation af CRISPR/Cas9-genereret gen Knockouts i Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning2 metode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening af bomuld genotyper for Reniform nematode resistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-gennemløb DNA plasmid multiplexing og Transfection ved hjælp af akustisk Nanodispenserings teknologi

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifikation af cirkulære RNAs ved hjælp af RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening og identifikation af RNA-lyddæmpningsundertrykkere fra udskillede effektorer af plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Identifikation af cellereceptorer ved hjælp af genome-skala CRISPR/Cas9 genetiske skærme

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...