Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

Wij danken J. Birchler, E. Bach en het Bloomington Drosophila Stock Center voor diverse Drosophila stammen; het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD studenten waaronder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, en Alex Chavez. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van american Thoracic Society aan J.L. en financiering van NIH: R01GM131044 aan W.X.L.

1. Voorbereiding drugsbibliotheek
<ol><li>Identificeer en bereid een geneesmiddelenbibliotheek voor om te worden gescreend met behulp van het juiste oplosmiddel bij een gewenste concentratie (bijvoorbeeld 10 mM in DMSO). OPMERKING: Een specifiek voorbeeld voor een geneesmiddelenbibliotheek is het Oncologie Set III van het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Compounds in deze set worden geleverd als 20 μL bij 10 mM in 100% DMSO in twee 96-well PP U-bodemplaten en opgeslagen bij ...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function.">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li><li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression.">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer.">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li><li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin:+Guardian+of+the+Genome.">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing.">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth.">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li></ol>

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij het reguleren van genexpressie. Het wordt steeds meer erkend bij kanker en kan dienen als een potentieel doelwit voor kankertherapie15,16,17,18. Kleine moleculen verbindingen worden vaak gebruikt in de ontwikkeling van geneesmiddelen als gevolg van voordelen in de productie, behoud, en metabolisme in menselijke licham...

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij genexpressie, bij het reguleren van chromosoomsegregatie tijdens celdeling en bij de bescherming tegen genoominstabiliteit1. Heterochromatine wordt beschouwd als een genrepressieregulator en ter bescherming van de chromosoomintegriteit tijdens celmitose2,3. Het wordt geassocieerd met de di- en tri-methylatie van histon H3 lysine 9 (H3K9me) tijdens afstamming strekkende verplichting 4,5. Bovendien wordt de aanwerving van Chroom-1-eiwitten (Heterochromatine 1) ook beschouwd als geassocieerd met heterochromatine en epigenetische onderdrukking van genexpressie6. Deze eiwitten zijn essentiële componenten en markers van heterochromatinevorming.
Aangezien genomische instabiliteit cellen in staat stelt genetische veranderingen te verwerven die carcinogenese bevorderen, wordt heterochromatine steeds meer erkend in de ontwikkeling van kanker en kan het doelwit zijn voor kankerbehandeling7,8. Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het helpen van heterochromatinevorming. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle maar efficiënte methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen. De screening wordt gedaan door Drosophila te behandelen met een bibliotheek van kleine moleculen. Deze methode maakt gebruik van een bonte oogkleur fenotype in de DX1Drosophila stam die wordt beïnvloed door heterochromatine niveaus. DX1 vliegen bevatten een tandem array van zeven P [lac-w] transgenes, die de bonte expressie / depressie, afhankelijk van heterochromatinisatie, daarom, de omvang van de variëteit in de oogkleur weerspiegelen de heterochromatine niveau. Specifiek, toenemende heterochromatine kan worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van bonte oogkleur (wit oog). Integendeel, afnemende heterochromatine zou worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van de P[lac-w] transgene expressie (rode ogen)9,10,11,12.
Daarom maken we gebruik van dit Drosophila transgene systeem dat een bonte oogkleur fenotype produceert, omdat de expressie direct gecorreleerd is aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig. Bij ontdekking van verbindingen die worden verdacht van het bevorderen van heterochromatine vorming, kunnen we bevestigen dit vermoeden met behulp van andere methoden, zoals westerse vlek. Deze heterochromatine-bevorderende stoffen kunnen in de toekomst verder worden ontwikkeld voor klinische studies bij patiënten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Drosophila is een uitstekend model organisme dat kan worden gebruikt om verbindingen die nuttig kunnen zijn voor kankertherapie scherm. De hier beschreven methode is een kosteneffectieve in vivo methode om heterochromatine-bevorderende verbindingen te identificeren met behulp van Drosophila. De Drosophila's DX1 stam, met een bonte oogkleur fenotype dat de omvang van heterochromatine vorming weerspiegelt, waardoor een hulpmiddel voor een heterochromatine-bevorderend drugscherm. Bij deze screeningmethode wordt oogvariatie gekwantificeerd op basis van het oppervlak van rode pigmentatie dat delen van het oog beslaat en wordt beoordeeld op een schaal van 1 tot 5. De screeningmethode is eenvoudig en gevoelig en maakt het mogelijk om verbindingen in vivo te testen. Drug screening met behulp van deze methode biedt een snelle en goedkope manier voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende geneesmiddelen die gunstige effecten kunnen hebben in kanker therapieën. Het identificeren van verbindingen die de vorming van heterochromatine bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van epigenetische mechanismen voor de ontwikkeling van kanker.

Dit protocol werd met succes gebruikt om verbindingen te screenen die heterochromatinevorming in Drosophilabevorderen , wat een efficiënt en goedkoop in vivo-systeem is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen(figuur 1). We onderzochten een kleine-molecuul drug bibliotheek, Oncologie Set III, die bestaat uit 97 FDA geautoriseerde oncologie drugs, met behulp van de DX1 stam van Drosophila melanogaster (Figuur 1B). De re...

Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is een veel gebruikt experimenteel model geschikt voor het screenen van geneesmiddelen met mogelijke toepassingen voor kankertherapie. Hier beschrijven we het gebruik van Drosophila bonte oogkleurfenotypes als een methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen.

Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het bevorderen van heterochromatine vorming. Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode voor het identificeren van kleine moleculen verbindingen die dit proces bevorderen. Ons screeningprotocol biedt een eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk te volgen in vivo systeem voor heterochromatine-bevorderende identificatie van geneesmiddelen.Het identificeren van verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen, kan leiden tot de ontdekking van mechanismen van kanker die herstellen en kankertherapie. Deze kosteneffectieve is gemeten voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende verbindingen in Drosophila kan ook worden gebruikt om vorm hits tellen als het is een preventieve maatregel om een hoogste cel pool van celscreening. Ons screening protocol kan ook nuttig zijn voor snelle pilot schermen als dit Drosophila TranSheet systeem produceert een bonte oogkleur fenotype dat omgekeerd is gecorreleerd aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig in de vlieg.Helpen om de procedure aan te tonen zal Kenny Dao, een student uit ons laboratorium. Na het identificeren en voorbereiden van een drugsbibliotheek voor een screening met behulp van een geschikt oplosmiddel, en de gewenste concentratie, kruisen drie mannelijke vliegen met drie of meer maagdelijke vrouwelijke vliegen in een 25 bij 95 millimeter voedsel flesje. Met negen millimeter standaard Drosophila voedingsmedium.Zet drie replica flesjes voor elke drug. Voeg een bedieningsbladje toe voor het scherm. En laat de vliegen om eieren te leggen voor twee dagen op kamertemperatuur.Op dag twee van het kruis verdooft u de vliegen met een korte uitbarsting van kooldioxide. En gooi de ouder vliegt in een fles met 70% ethanol. Vervolgens verdun elke drug verbinding uit de oorspronkelijke voorraad om micro molaire uiteindelijke concentratie bij te wonen in 33%DMSO in water.En voeg 60 microliter van het medicijn toe, of de controle 33%DMSO alleen, bovenop het vliegvoedsel. Bevestig dan dat er geen oudervliegen aanwezig zijn in de flesjes. En voeg de medicijnoplossing toe aan de juiste flesjes.Twee dagen nadat de F1-vliegen tevoorschijn komen, brengen verdoofde vliegen van één flesje tegelijk over op een poreus ontleedpad met kooldioxide die onder het filterpapier doorfiltert. Onder een ontledenmicroscoop, onderzoeken elke hele vlieg, het identificeren van alle heterozygoot mannen door hun gebrek aan de krullend o-dominante krullende vleugel fenotype. Score de kleur van de ogen van elke heterozygoot man op een schaal van een tot vijf.Met een een score wordt toegewezen aan een minder dan 5% rode verspreide oog totale oppervlakte. Voeg een twee score aan vliegen met een 6 tot 25% rode vlek oog totale oppervlakte. Een drie tot vliegt met een 26 tot 50% rode vlek oog totale oppervlakte.Een vier tot vliegt met een 51 tot 75% rode vlek oog totale oppervlakte. En een vijf vliegt met een meer dan 75% rode vlek oog totale oppervlakte. Bereken vervolgens de gemiddelde kleurindex van alle mannetjes uit elke flacon gescoord in drievoud.Om te bevestigen dat de verbindingen inderdaad heterochromatinevorming bevorderen, kan een andere validatietechniek, zoals westelijke blotting, worden uitgevoerd. In dit representatieve experiment, een klein molecuul drug bibliotheek, oncologie set 3, die is samengesteld uit 97 FDA geautoriseerde oncologie drugs, werd gescreend met behulp van de DX1 stam van Drosophila Melanogaster. Volgens de screening test, methotrexaat, gecodeerd als E7 in de bibliotheek, veroorzaakt de meeste variatie binnen de Dx1 stam.Suggereren dat methotrexaat zou de meest veelbelovende heterochromatine-bevorderende drug voor toekomstige kanker gerichte therapie. Om verder te bevestigen dat deze verbinding heterochromatine transformatie bevordert, werden westerse vlekkengegevens uitgevoerd. Het aantonen van de up regulatie van heterochromatine formaat in geassocieerd eiwit, H3K9 trimethylation, en het valideren van de screening resultaten.De kritische stap is het scoren van de oogkleur van elk van de witte 11-18 DX1 heterozygoot mannelijke vliegt op een schaal van een tot vijf volgens een vooraf bepaalde studie route. We kunnen westerse vlekken of immunostaining gebruiken om de hits te bevestigen. De ontdekking van verbindingen waarvan wordt vermoed dat ze heterochromatinevorming bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van het genetisch mechanisme iv van kankerontwikkeling en klinische proeven bij menselijke patiënten.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening van katoen genotypes voor Reniform nematode resistentie

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Gebruik van Drosophila S2-cellen voor Live beeldvorming van celdeling

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...