Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
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Wir danken J. Birchler, E. Bach und dem Bloomington Drosophila Stock Center für verschiedene Drosophila-Sorten; das National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD Studenten wie Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza und Alex Chavez. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium der American Thoracic Society an J.L. und die Finanzierung durch NIH: R01GM131044 an W.X.L. unterstützt.

1. Vorbereitung der Drogenbibliothek
<ol><li>Identifizieren und vorbereiten Sie eine Arzneimittelbibliothek, die mit geeignetem Lösungsmittel in einer gewünschten Konzentration (z. B. 10 mM in DMSO) untersucht werden soll. HINWEIS: Ein spezifisches Beispiel für eine Arzneimittelbibliothek ist das Onkologie-Set III des National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Verbindungen in diesem Set werden als 20 l bei 10 mM in 100% DMSO in zwei 96-Well PP U-Bodenplatten geliefert und bei -20 °...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. 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R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. 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Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt. Es wird immer mehr bei Krebs erkannt und kann als potenzielles Ziel für die Krebstherapie dienen15,16,17,18. Kleinmolekulare Verbindungen werden häufig in der Arzneimittelentwicklung aufgrund von Vorteilen bei der Herstellung, Konservierung und Stoffwechsel in menschlichen...

Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Genexpression, bei der Regulierung der Chromosomensegregation während der Zellteilung und beim Schutz vor Genominstabilität1spielt. Heterochromatin gilt als Regulierer für die Genrepression und zum Schutz der Chromosomenintegrität bei der Zellmitose2,3. Es ist mit der Di- und Tri-Methylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me) während der AbstammungSverpflichtung4,5verbunden. Darüber hinaus wird die Rekrutierung von Chromodomain-Proteinen von Heterochromatin Protein 1 (HP1) auch als mit Heterochromatin und epigenetischer Unterdrückung der Genexpression6assoziiert. Diese Proteine sind wesentliche Bestandteile und Marker der Heterochromatinbildung.
Da die genomische Instabilität es Zellen ermöglicht, genetische Veränderungen zu erwerben, die die Karzinogenese fördern, wird Heterochromatin in der Krebsentwicklung immer stärker anerkannt und kann für dieKrebsbehandlung7,8ins Visier genommen werden. Derzeit gibt es keine Medikamente, die gut etabliert sind bei der Unterstützung der Heterochromatin-Bildung. Hier präsentieren wir eine einfache und schnelle und dennoch effiziente Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Das Screening erfolgt durch die Behandlung von Drosophila mit einer Bibliothek von kleinmolekularen Medikamenten. Diese Methode nutzt einen bunten Augenfarben-Phänotyp in der DX1Drosophila-Sorte, der von Heterochromatin-Spiegeln beeinflusst wird. DX1-Fliegen enthalten ein Tandem-Array von sieben P[lac-w]-Transgenen, die je nach Heterochromatinisierung die bunte Expression/Depression aufweisen, daher spiegelt das Ausmaß der Variegation in der Augenfarbe den Heterochromatinspiegel wider. Insbesondere konnte das zunehmende Heterochromatin durch den steigenden Anteil der bunten Augenfarbe (weißes Auge) nachgewiesen werden. Im Gegenteil, abnehmendes Heterochromatin würde durch den steigenden Anteil der P[lac-w] Transgenexpression (rotes Auge)9,10,11,12erkannt.
Daher nutzen wir dieses Drosophila-Transgensystem, das einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, da seine Expression direkt mit der Menge an Heterochromatin korreliert. Bei der Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, können wir diesen Verdacht mit anderen Methoden wie Western Blot bestätigen. Diese heterochromatinfördernden Substanzen können in Zukunft für klinische Studien bei Patienten weiterentwickelt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu überprüfen, die für die Krebstherapie nützlich sein könnten. Die hier beschriebene Methode ist eine kostengünstige In-vivo-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen mit Drosophila. Die DX1-Sorte der Drosophila, die einen bunten Augenfarb-Phänotyp hat, der die Ausdehnungen der Heterochromatin-Bildung widerspiegelt und damit ein Werkzeug für einen heterochromatinfördernden Wirkstoff-Bildschirm bietet. Bei dieser Screening-Methode wird die Augenvariegation auf der Grundlage der Oberfläche der roten Pigmentierung quantifiziert, die Teile des Auges einnimmt, und auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Das Screening-Verfahren ist einfach und empfindlich und ermöglicht die Prüfung von Verbindungen in vivo. Arzneimittel-Screening mit dieser Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Heterochromatin fördernde Medikamente zu identifizieren, die positive Auswirkungen in Krebstherapeutika haben könnten. Die Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung von Heterochromatin fördern, könnte auch zur Entdeckung epigenetischer Mechanismen der Krebsentwicklung führen.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Verbindungen zu untersuchen, die die Heterochromatinbildung in Drosophilafördern, das ein effizientes und kostengünstiges In-vivo-System für die Arzneimittelentwicklung ist (Abbildung 1). Wir haben eine kleinmolekulare Arzneimittelbibliothek, Oncology Set III, untersucht, die aus 97 von der FDA zugelassenen Onkologie-Medikamenten besteht, mit dem DX1-Stamm von Drosophila melanogaster (Abbildun...

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A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila ist ein weit verbreitetes experimentelles Modell, das für das Screening von Medikamenten mit potenziellen Anwendungen für die Krebstherapie geeignet ist. Hier beschreiben wir die Verwendung von Drosophila-Variegated-Augenfarbphänotypen als Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Drosophila

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Derzeit gibt es keine Medikamente, die bei der Förderung der Heterochromatin-Bildung gut etabliert sind. Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung kleiner Molekülverbindungen, die diesen Prozess fördern. Unser Screening-Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, leicht zu verfolgendes In-vivo-System zur Heterochromatin-fördernden Arzneimittelidentifikation.Die Identifizierung von Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern, kann zur Entdeckung von Mechanismen von Krebs führen, die sich vermändern und Krebstherapie. Diese kostengünstige wurde für die Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen in Drosophila gemessen könnte auch verwendet werden, um FormTreffer zu zählen, da es eine vorbeugende Maßnahme zu einem höchsten Zellpool von Zellscreening ist. Unser Screening-Protokoll könnte auch für schnelle Pilotbildschirme nützlich sein, da dieses Drosophila TranSheet-System einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, der umgekehrt mit der Menge an Heterochromatin korreliert, die in der Fliege vorhanden ist.Mit dabei, das Verfahren zu demonstrieren, wird Kenny Dao helfen, ein Student aus unserem Labor. Nach der Identifizierung und Vorbereitung einer Arzneimittelbibliothek für ein Screening mit einem geeigneten Lösungsmittel und der gewünschten Konzentration kreuzen Sie drei männliche Fliegen mit drei oder mehr jungfräulichen weiblichen Fliegen in einer 25 mal 95 Millimeter großen Lebensmittelflasche. Mit neun Millimetern Standard-Drosophila-Lebensmittelmedium.Richten Sie drei Replik-Fläschchen für jedes Medikament ein. Fügen Sie eine Durchstechflasche für den Bildschirm hinzu. Und lassen Sie die Fliegen Eier für zwei Tage bei Raumtemperatur legen.Am zweiten Tag des Kreuzes, beästhesieren Sie die Fliegen mit einem kurzen Ausbruch von Kohlendioxid. Und entsorgen Sie die Elternfliegen in einer Flasche mit 70% Ethanol. Als nächstes verdünnen Sie jede Wirkstoffverbindung aus dem Ausgangsbestand, um die mikromolare Endkonzentration in 33% DMSO in Wasser zu erreichen.Und fügen Sie 60 Mikroliter des Medikaments, oder die Kontrolle 33%DMSO allein, auf die Fliege Lebensmittel. Bestätigen Sie dann, dass keine Elternfliegen innerhalb der Durchstechflaschen vorhanden sind. Und fügen Sie die Arzneimittellösung zu den entsprechenden Fläschchen hinzu.Zwei Tage nach dem Auftauchen der F1-Fliegen übertragen Sie anästhesierte Fliegen von einer Durchstechflasche nach der anderen auf ein poröses Sezieren, wobei Kohlendioxid unter dem Filterpapier durchfiltriert wird. Unter einem Sezieren mikroskop, untersuchen Sie jede ganze Fliege, identifizieren alle heterozygotmännchen Männchen durch ihr Fehlen der lockigen o-dominanten lockigen Flügel Phänotyp. Erzielen Sie die Augenfarbe jedes heterozygoten Männchens auf einer Skala von eins bis fünf.Mit einer Punktzahl, die einer Gesamtfläche von weniger als 5% rot verstreuten Augen zugewiesen wird. Fügen Sie zwei Punkte zu Fliegen mit einer Gesamtfläche des roten Fleckauges von 6 bis 25 % hinzu. Eine Drei-zu-Fliegen mit einer Gesamtfläche von 26 bis 50% rotem Fleckauge.Eine Vier-zu-Fliegen mit einer Gesamtfläche von 51 bis 75% rotem Fleckauge. Und eine Fünf fliegt mit einer Gesamtfläche von mehr als 75% rotem Fleckauge. Dann berechnen Sie den mittleren Farbindex aller Männchen aus jeder Durchstechflasche in Dreifache bewertet.Um zu bestätigen, dass die Verbindungen tatsächlich die Heterochromatinbildung fördern, kann eine andere Validierungstechnik, wie z. B. Western Blotting, durchgeführt werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine kleine Molekül-Arzneimittelbibliothek, Onkologie-Set 3, die aus 97 FDA-zugelassenen Onkologie-Medikamenten besteht, mit dem DX1-Stamm von Drosophila Melanogaster untersucht. Laut Screening-Test verursachte Methotrexat, in der Bibliothek als E7 kodiert, die meisten Variationen innerhalb des Dx1-Stamms.Der Vorschlag, dass Methotrexat das vielversprechendste Heterochromatin-fördernde Medikament für zukünftige krebsgezielte Therapie sein könnte. Um weiter zu bestätigen, dass diese Verbindung die Heterochromatin-Transformation fördert, wurden westliche Blot-Daten durchgeführt. Nachweis der Bisregulation des Heterochromatin-Formats im assoziierten Protein, H3K9-Trimethylierung, und Validierung der Screening-Ergebnisse.Der entscheidende Schritt ist die Bewertung der Augenfarbe jeder der weißen 11-18 DX1 heterozygoten männlichen Fliegen auf einer Skala von eins bis fünf nach einer vorgegebenen Studienroute. Wir können westliche Flecken oder Immunostaining verwenden, um die Treffer zu bestätigen. Die Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, kann auch zur Entdeckung des IV-Genetischen Mechanismus der Krebsentwicklung und klinischer Studien bei menschlichen Patienten führen.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Forschung

Genetik

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

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Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening Cotton Genotypes auf Reniform Nematode Resistenz

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

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Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

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Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...