Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
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Ringraziamo J. Birchler, E. Bach e il Bloomington Drosophila Stock Center per vari ceppi di Drosophila; il Programma di Terapia Di Sviluppo del National Cancer Institute (NCI) per la libreria di farmaci per piccole molecole del Set di Oncologia; Studenti universitari UCSD tra cui Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza e Alex Chavez. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione di ricerca dalla American Thoracic Society a J.L. e dai finanziamenti da NIH: R01GM131044 a W.X.L.

1. Preparazione della biblioteca di farmaci
<ol><li>Identificare e preparare una libreria di farmaci da vagliare utilizzando un solvente appropriato ad una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mM in DMSO). NOTA: Un esempio specifico per una biblioteca di farmaci è l'Oncologia Set III dal National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). I composti in questo set sono forniti come 20 a 10 mM in 100% DMSO in due piastre U-bottom PP 96-well e conservate a -20 gradi centigradi. Le mappe NCI ...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. 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R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. 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L'eteocromatica è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'espressione genica. Sta diventando sempre più riconosciuto nel cancro e può servire come potenziale bersaglio per la terapia del cancro15,16,17,18. Composti di piccole molecole sono comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci a causa di vantaggi nella produzione, conservazione, e metabolism...

L'eterocromatina è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nell'espressione genica, nella regolazione della segregazione cromosomica durante la divisione cellulare e nella protezione contro l'instabilità delgenoma 1. L'eterocromatina è stata considerata un regolatore di repressione genica e per proteggere l'integrità cromosomica durante la mitosi cellulare2,3. È associato con la di- e tri-metilazione di istone H3 lisina 9 (H3K9me) durante l'impegno di lignaggio4,5. Inoltre, il reclutamento di proteine del cromodominio Heterochromatin Protein 1 (HP1) è anche considerato associato all'eterocromatica e alla repressione epigenetica dell'espressione genica6. Queste proteine sono componenti essenziali e marcatori della formazione di eterocromatica.
Poiché l'instabilità genomica consente alle cellule di acquisire alterazioni genetiche che promuovono la carcinogenesi, l'eterocromatina sta diventando sempre più riconosciuta nello sviluppo del cancro e può essere mirata per il trattamento del cancro7,8. Attualmente, non ci sono farmaci che sono ben consolidati nell'assistere la formazione di eterocromatina. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce ma efficiente per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina. Lo screening viene fatto trattando la Drosophila con una libreria di farmaci di piccole molecole. Questo metodo sfrutta un fenotipo del colore degli occhi variegato nel ceppodi Drosophila DX1che è influenzato dai livelli di eteromatina. Le mosche DX1 contengono una matrice di tandem di sette transgenie P[lac-w], che hanno l'espressione/depressione variegata a seconda dell'eteocromaticizzazione, quindi, l'entità della varietà nel colore degli occhi riflette il livello di eteocromatica. In particolare, l'aumento dell'eteocromatica potrebbe essere rilevato dall'aumento della proporzione di colore degli occhi variegato (occhio bianco). Al contrario, la diminuzione dell'eterocromatina sarebbe rilevata dall'aumento della proporzione dell'espressione transgenica P[lac-w] (occhio rosso)9,10,11,12.
Pertanto, approfittiamo di questo sistema transgene di Drosophila che produce un fenotipo del colore degli occhi variegato poiché la sua espressione è direttamente correlata alla quantità di etecromatina presente. Dopo la scoperta di composti che sono sospettati di promuovere la formazione di etecromatina, possiamo confermare questo sospetto utilizzando altri metodi come macchia occidentale. Queste sostanze che promuovono l'eteocromatina possono essere ulteriormente sviluppate per gli studi clinici in pazienti in futuro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

La drosophila è un organismo modello eccellente che può essere utilizzato per vagliare composti che potrebbero essere utili per la terapia del cancro. Il metodo qui descritto è un metodo in vivo conveniente per identificare composti che promuovono l'eterocromatina utilizzando la Drosophila. Ceppo DX1 della Drosophila, con un fenotipo di colore degli occhi variegato che riflette le estensioni della formazione di etecromatina, fornendo così uno strumento per uno schermo farmaco che promuove l'eteocromatina. In questo metodo di screening, la varianza degli occhi viene quantificata in base alla superficie della pigmentazione rossa che occupa parti dell'occhio e viene valutata su una scala da 1 a 5. Il metodo di screening è semplice e sensibile e consente di testare composti in vivo. Lo screening farmacologico con questo metodo fornisce un modo rapido ed economico per identificare farmaci che promuovono l'eteocromatina che potrebbero avere effetti benefici nelle terapie contro il cancro. Identificare composti che promuovono la formazione di eteocromatica potrebbe anche portare alla scoperta di meccanismi epigenetici dello sviluppo del cancro.

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per vagliare composti che promuovono la formazione di etecromatina nella Drosophila, che è un sistema in vivo efficiente e a basso costo per lo sviluppo di farmaci (Figura 1). Abbiamo proiettato una libreria di farmaci di piccole molecole, Oncologia Set III, che è composto da 97 farmaci oncologici autorizzati FDA, utilizzando il ceppo DX1 di Drosophila melanogaster (Figura 1B...

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A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

La drosophila è un modello sperimentale ampiamente utilizzato adatto per lo screening di farmaci con potenziali applicazioni per la terapia del cancro. Qui, descriviamo l'uso di fenotipi di colore degli occhi variati della Drosophila come metodo per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina.

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Attualmente non ci sono farmaci che sono ben consolidati nel promuovere la formazione di eterocromatina. Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per identificare i composti di piccole molecole che promuovono questo processo. Il nostro protocollo di screening fornisce un sistema in vivo semplice, economico e facile da seguire per l'identificazione dei farmaci che promuovono l'eterocromatina.L'identificazione di composti che promuovono la formazione di eterocromatina può portare alla scoperta di meccanismi di cancro che riparano e terapia del cancro. Questo costo efficace è stato misurato per identificare composti che promuovono l'eterocromatina in Drosophila potrebbe anche essere usato per contare i colpi di forma in quanto è una misura preventiva per un pool di cellule più alto di screening cellulare. Il nostro protocollo di screening potrebbe anche essere utile per schermi pilota veloci in quanto questo sistema Drosophila TranSheet produce un fenotipo variegato del colore degli occhi che è inversamente correlato alla quantità di eterocromatina presente al volo.Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Kenny Dao, uno studente universitario del nostro laboratorio. Dopo aver identificato e preparato una libreria di farmaci per uno screening utilizzando un solvente appropriato e la concentrazione desiderata, attraversare tre mosche maschili con tre o più mosche femminili vergini in una fiala alimentare da 25 per 95 millimetri. Con nove millimetri di mezzo alimentare standard Drosophila.Impostare tre flaconcini replica per ogni farmaco. Aggiungere una fiala di controllo per lo schermo. E consentire alle mosche di deporre le uova per due giorni a temperatura ambiente.Il secondo giorno della croce, anestetizza le mosche con una breve esplosione di anidride carbonica. E scartare le mosche dei genitori in una bottiglia contenente il 70% di etanolo. Successivamente, diluire ogni composto farmacologico dallo stock iniziale per partecipare alla concentrazione finale di micro molare nel 33% di DMSO in acqua.E aggiungere 60 microlitri del farmaco, o il controllo 33%DMSO da solo, sopra il fly food. Quindi conferma che nessuna mosca genitore è presente all'interno delle fiale. E aggiungi la soluzione farmacologica alle fiale appropriate.Due giorni dopo l'emergere delle mosche di F1, trasferire le mosche anestetizzate da una fiala alla volta su un cuscinetto di sezionamento poroso con anidride carbonica che filtra da sotto la carta filtrante. Al microscopio sezionato, esaminare ogni mosca intera, identificando tutti i maschi eterozigoti per la loro mancanza del fenotipo riccio o-dominante delle ali riccie. Segna il colore degli occhi di ogni maschio eterozigote su una scala da uno a cinque.Con un punteggio assegnato a una superficie totale degli occhi sparsi inferiore al 5%. Aggiungi un punteggio di due alle mosche con una superficie totale degli occhi da 6 a 25%. Un tre per volare con una superficie totale degli occhi macchiati dal 26 al 50%.Un quattro per volare con una superficie totale degli occhi macchiati dal 51 al 75%. E un cinque vola con una superficie totale degli occhi a macchia rossa superiore al 75%. Quindi calcola l'indice di colore medio di tutti i maschi da ogni flaconcino segnato in triplice copia.Per confermare che i composti promuovono effettivamente la formazione di eterocromatina, è possibile eseguire una tecnica di convalida diversa, come l'assorbimento occidentale. In questo esperimento rappresentativo, una libreria di farmaci a piccole molecole, l'oncologia set 3, che è composta da 97 farmaci oncologici autorizzati dalla FDA, è stata schermata usando il ceppo DX1 di Drosophila Melanogaster. Secondo il saggio di screening, il metotrexato, codificato come E7 in libreria, ha causato la maggior variazione all'interno del ceppo Dx1.Suggerendo che il metotrexato potrebbe essere il farmaco più promettente per la promozione dell'eterocromatina per la futura terapia mirata al cancro. Per confermare ulteriormente che questo composto promuove la trasformazione dell'eterocromatina, sono stati eseguiti dati western blot. Dimostrare la regolazione up del formato eterocromatina nella proteina associata, trietilazione H3K9 e convalidare i risultati dello screening.Il passo critico è segnare il colore degli occhi di ciascuna delle mosche eterozigoti bianche 11-18 DX1 su una scala da uno a cinque secondo una via di studio predeterminata. Possiamo usare macchie occidentali o immunosottenimenti per confermare i colpi. La scoperta di composti che si sospetta promuovano la formazione di eterocromatina può anche portare alla scoperta del meccanismo genetico IV dello sviluppo del cancro e degli studi clinici in pazienti umani.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

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