Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

Vi takker J. Birchler, E. Bach og Bloomington Drosophila Stock Center for ulike Drosophila stammer; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for Oncology Set småmolekyl etlegemiddelbibliotek; UCSD lavere studenter inkludert Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, og Alex Chavez. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av et forskningsstipend fra American Thoracic Society til J.L. og finansiering fra NIH: R01GM131044 til W.X.L.

1. Forberedelse av legemiddelbibliotek
<ol><li>Identifiser og klargjør et legemiddelbibliotek som skal screenes ved hjelp av passende løsemiddel ved ønsket konsentrasjon (f.eks. 10 mM i DMSO). MERK: Et spesifikt eksempel for et legemiddelbibliotek er Oncology Set III fra National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Forbindelser i dette settet leveres som 20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i to 96-brønn PP U-bunnplater og lagret ved -20 °C. NCI Plate kart, og de grunnleggende kjemiske data...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function.">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li><li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression.">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer.">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li><li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin:+Guardian+of+the+Genome.">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing.">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth.">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li></ol>

Heterochromatin er en kondensert form for DNA som spiller en sentral rolle i reguleringen av genuttrykk. Det blir stadig mer anerkjent i kreft og kan tjene som et potensielt mål for kreftbehandling15,16,17,18. Småmolekylforbindelser brukes ofte i legemiddelutvikling på grunn av fordeler ved produksjon, bevaring og metabolisme i menneskelige organer. For å identifisere heterochromatinfremmen...

Heterochromatin er en kondensert form for DNA som spiller en sentral rolle i genuttrykk, i å regulere kromosomsegregering under celledeling, og i å beskytte mot genom ustabilitet1. Heterochromatin har blitt ansett for å være en genundertrykkelse regulator og for å beskytte kromosom integritet under celle mitose2,3. Det er forbundet med di- og tri-metylering av histone H3 lysine 9 (H3K9me) under avstamning forpliktelse4,5. Videre anses rekruttering av heterochromatin Protein 1 (HP1) kromodomainproteiner også å være forbundet med heterochromatin og epigenetisk undertrykkelse av genuttrykk6. Disse proteinene er viktige komponenter og markører for heterochromatindannelse.
Siden genomisk ustabilitet gjør det mulig for celler å skaffe genetiske endringer som fremmer karsinogenese, blir heterochromatin mer anerkjent i kreftutvikling og kan være målrettet for kreftbehandling7,8. For tiden er det ingen stoffer som er godt etablert i å bistå heterokromatindannelse. Her presenterer vi en enkel og rask, men effektiv metode for screening av småmolekylforbindelser som fremmer heterochromatindannelse. Screeningen gjøres ved å behandle Drosophila med et bibliotek med småmolekylmedisiner. Denne metoden drar nytte av en spraglete øyfarge fenotype i DX1Drosophila-stammen som påvirkes av heterochromatinnivåer. DX1 fluer inneholder en tandem rekke av syv P [lac-w] transgenes, som har variert uttrykk / depresjon avhengig av heterochromatinization, derfor, omfanget av variegation i øyenfargen gjenspeiler heterochromatin nivå. Spesielt kan økende heterochromatin oppdages av den økende andelen av spraglete øyenfarge (hvitt øye). Tvert imot vil avtagende heterokromatin oppdages av den økende andelen av P[lac-w] transgene uttrykket (røde øyne)9,10,11,12.
Derfor drar vi nytte av dette Drosophila transgene systemet som produserer en spraglete øyendelsfenotype siden uttrykket er direkte korrelert til mengden heterochromatin tilstede. Ved oppdagelsen av forbindelser som mistenkes for å fremme heterochromatindannelse, kan vi bekrefte denne mistanken ved hjelp av andre metoder som vestlig blot. Disse heterokromatinfremmende stoffene kan videreutvikles for kliniske studier hos pasienter i fremtiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Drosophila er en utmerket modell organisme som kan brukes til å screene forbindelser som kan være nyttig for kreftbehandling. Metoden som er beskrevet her er en kostnadseffektiv in vivo metode for å identifisere heterochromatin-fremme forbindelser ved hjelp av Drosophila. Den Drosophila DX1 DX1 stamme, har en spraglete øyendels fenotype som gjenspeiler omfanget av heterochromatin formasjon, og dermed gi et verktøy for en heterochromatin-fremme narkotika skjerm. I denne screeningmetoden kvantifiseres øyevariasjon basert på overflatearealet av rød pigmentering som opptar deler av øyet og scores på en skala fra 1 til 5. Screeningmetoden er enkel og følsom og gjør det mulig å teste forbindelser in vivo. Narkotikascreening ved hjelp av denne metoden gir en rask og rimelig måte å identifisere heterochromatinfremmende legemidler som kan ha gunstige effekter i kreftterapeutiske midler. Identifisere forbindelser som fremmer dannelsen av heterochromatin kan også føre til oppdagelsen av epigenetiske mekanismer for kreftutvikling.

Denne protokollen ble vellykket brukt til å screene forbindelser som fremmer heterochromatindannelse i Drosophila, som er et effektivt og rimelig in vivo-system for narkotikautvikling (Figur 1). Vi screenet et lite molekyl legemiddelbibliotek, Oncology Set III, som består av 97 FDA autoriserte onkologi medisiner, ved hjelp av DX1-stammen av Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultatene for et betydelig legemiddel v...

Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila er en mye brukt eksperimentell modell egnet for screening av legemidler med potensielle anvendelser for kreftbehandling. Her beskriver vi bruken av Drosophila spraglete øyefarge fenotyper som en metode for screening av småmolekylforbindelser som fremmer heterochromatindannelse.

En screeningmetode for identifisering av heterochromatinfremmende legemidler ved hjelp av drosofil

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

For tiden er det ingen stoffer som er godt etablert i å fremme heterochromatindannelse. Her presenterer vi en enkel og effektiv metode for å identifisere små molekylforbindelser som fremmer denne prosessen. Vår screeningprotokoll gir et enkelt, billig, lett å følge in vivo-systemet for heterochromatinfremmende narkotikaidentifikasjon.Identifisere forbindelser som fremmer heterochromatin dannelse kan føre til oppdagelsen av mekanismer for kreft som reparerer og kreftbehandling. Denne kostnadseffektive har blitt målt for å identifisere heterochromatin-fremme forbindelser i Drosophila kan også brukes til å telle form treff som det er et forebyggende tiltak for en høyeste celle pool av celle screening. Vår screeningprotokoll kan også være nyttig for raske pilotskjermer, da dette Drosophila TranSheet-systemet produserer en spraglete øyenfargefenotype som er omvendt korrelert med mengden heterochromatin tilstede i fluen.Å demonstrere prosedyren vil være Kenny Dao, en undergrad student fra laboratoriet vårt. Etter å ha identifisert og forberedt et legemiddelbibliotek for en screening ved hjelp av et passende løsningsmiddel, og ønsket konsentrasjon, kryss tre mannlige fluer med tre eller flere jomfrukvinnefluer i et 25 x 95 millimeter mat hetteglass. Med ni millimeter standard Drosophila mat medium.Sett opp tre replika hetteglass for hvert stoff. Legg til ett kontrollhettal for skjermen. Og la fluene legge egg i to dager ved romtemperatur.På dag to av korset, bedøve fluene med et kort utbrudd av karbondioksid. Og kast foreldrefluene i en flaske som inneholder 70% etanol. Deretter fortynner hvert legemiddel sammensatte fra den første bestanden for å delta mikro molar endelig konsentrasjon i 33% DMSO i vann.Og legg til 60 mikroliter av stoffet, eller kontrollen 33% DMSO alene, på toppen av flymaten. Bekreft deretter at ingen foreldrefluer er tilstede i hetteglassene. Og legg til legemiddelløsningen til de riktige hetteglassene.To dager etter at F1-fluene kommer frem, overfører du bedøvede fluer fra ett hetteglass om gangen til en porøs disseksjonspute med karbondioksidfiltrering gjennom fra under filterpapiret. Under et dissekerende mikroskop, undersøk hver hel flue, og identifiser alle de heterozygøse mennene ved deres mangel på den krøllete o-dominerende krøllete vingefenotypen. Score øyenfargen til hver heterozygous mann på en skala fra en til fem.Med en poengsum som tildeles et mindre enn 5% rødt spredt øye totalt overflateareal. Legg til en to score til fluer med en 6 til 25% rød flekk totalt overflateareal. En tre til fluer med en 26 til 50% rød flekk øye totalt overflateareal.En fire til flyr med en 51 til 75% rød flekk øye totalt overflateareal. Og en fem fluer med en større enn 75% rød flekk øye totalt overflateareal. Beregn deretter gjennomsnittlig fargeindeks for alle mennene fra hvert hetteglass scoret i triplikate.For å bekrefte at forbindelsene faktisk fremmer heterochromatindannelse, kan en annen valideringsteknikk, for eksempel vestlig blotting, utføres. I dette representative eksperimentet ble et lite molekylstoffbibliotek, onkologi satt 3, som består av 97 FDA-autoriserte onkologimedisiner, screenet ved hjelp av DX1-stammen av Drosophila Melanogaster. Ifølge screeninganalysen forårsaket metotreksat, kodet som E7 i biblioteket, mest variasjon i Dx1-stammen.Noe som tyder på at metotreksat kan være det mest lovende heterochromatin-fremmende stoffet for fremtidig kreft målrettet terapi. For ytterligere å bekrefte at denne forbindelsen fremmer heterochromatin transformasjon, ble vestlige blot data utført. Viser opp regulering av heterochromatin formatin assosiert protein, H3K9 trimetylering, og validere screening resultatene.Det kritiske trinnet er å score øyenfargen til hver av de hvite 11-18 DX1 heterozygous mannlige fluer på en skala fra en til fem i henhold til en forhåndsbestemt studierute. Vi kan bruke vestlige flekker eller immunstaining for å bekrefte treffene. Oppdagelsen av forbindelser som mistenkes for å fremme heterokromatindannelse kan også føre til oppdagelsen av IV genetisk mekanisme for kreftutvikling og kliniske studier hos menneskelige pasienter.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Høy gjennomstrømming identifikasjon av synergistisk rusmiddelkombinasjoner av overlapping2 metoden

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening Cotton genotyper for kantet nematode Resistance

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Høy-gjennomstrømning DNA plasmider multipleksing og Transfeksjoner bruke akustisk Nanodispensing teknologi

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifikasjon av sirkulær RNAs ved hjelp av RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Bruk av Drosophila S2 Cells for Live Imaging av Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening og identifisering av RNA-dempende suppressorer fra utskillede effektorer av plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Cell Surface Reseptor identifikasjon ved hjelp av genom-skala CRISPR / Cas9 genetiske skjermer

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...