Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

Мы благодарим Д. Бирчлера, Э. Баха и Блумингтон дрозофила фондовый центр для различных штаммов drosophila; Национальный институт рака (NCI) Программа развития терапии для онкологии Установить маломолекулярной библиотеки наркотиков; СТУДЕНТы UCSD, включая Эми Чанг, Taesik You, Джессика Сингх-Банга, Рейчел Меза, и Алекс Чавес. Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны исследовательским грантом Американского торакального общества J.L. и финансированием от NIH: R01GM131044 до W.X.L.

1. Подготовка библиотеки наркотиков
<ol><li>Определить и подготовить библиотеку лекарственных средств для проверки с использованием соответствующего растворителя в нужной концентрации (например, 10 мМ в ДМСО). ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный пример для библиотеки наркотиков является онкология ...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function.">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li><li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression.">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer.">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li><li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin:+Guardian+of+the+Genome.">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing.">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth.">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li></ol>

Гетерохроматин является конденсированной формой ДНК, которая играет центральную роль в регулировании экспрессии генов. Он становится все более узнаваемым при раке и может служить потенциальной мишенью для терапии рака15,16,17,<sup cl...

Гетерохроматин является конденсированной формой ДНК, которая играет центральную роль в экспрессии генов, в регуляции хромосомой сегрегации во время деления клеток, а также в защите от нестабильности генома1. Гетерохроматин считается регулятором генных репрессий и защищает целостность хромосомы при клеточном митозах2,,3. Это связано с ди- и три-метилирования гистон H3 лизин 9 (H3K9me) во время линии обязательств4,5. Кроме того, набор хетерохроматин Белок 1 (HP1) хромодоменов белков также считается связанным с гетерохроматин и эпигенетическое подавление экспрессии генов6. Эти белки являются важными компонентами и маркерами гетерохроматина формирования.
Поскольку геномная нестабильность позволяет клеткам приобретать генетические изменения, которые способствуют канцерогенезу, гетерохроматин становится все более признанным в развитии рака и может быть направлена на лечение рака7,8. В настоящее время нет препаратов, которые хорошо зарекомендовали себя в оказании помощи гетерохроматин формирования. Здесь мы представляем простой и быстрый, но эффективный метод скрининга маломолекулярных соединений, способствующих образованию гетерохроматина. Скрининг проводится путем лечения дрозофилы с библиотекой маломолекулярных препаратов. Этот метод использует пестрый фенотип цвета глаз в штамме DX1Drosophila, который находится под влиянием уровня гетерохроматина. Мухи DX1 содержат тандемный массив из семи трансгенов P'lac-w, которые имеют пестрое выражение/депрессию в зависимости от гетерохроматинизации, поэтому степень разнозения цвета глаз отражает уровень гетерохроматина. В частности, увеличение гетерохроматина может быть обнаружено ростом доли пестрый цвет глаз (белый глаз). Напротив, снижение гетерохроматина будет обнаружено ростом доли трансгенного выражения P'lac-w (красный глаз)9,10,11,12.
Таким образом, мы пользуемся этой системой Transgene Drosophila, которая производит пестрый фенотип цвета глаз, так как его выражение напрямую коррелирует с количеством гетерохроматина настоящее время. При обнаружении соединений, которые, как предполагается, способствуют образованию гетерохроматина, мы можем подтвердить это подозрение, используя другие методы, такие как западная подачка. Эти гетерохроматин-продвигающие вещества могут быть дополнительно разработаны для клинических испытаний у пациентов в будущем.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Дрозофила является отличной моделью организма, которые могут быть использованы для проверки соединений, которые могут быть полезны для терапии рака. Описанный здесь метод является экономически эффективным методом in vivo для выявления гетерохроматина, продвигающих соединения с помощью дрозофилы. DX1 штаммА Drosophila, имея пестрый фенотип цвета глаз, который отражает масштабы образования гетерохроматина, тем самым обеспечивая инструмент для гетерохроматина содействия наркотиков экрана. В этом методе скрининга, разновидность глаз количественно на основе поверхности красной пигментации, занимающей части глаза и забил по шкале от 1 до 5. Метод скрининга прост и чувствителен и позволяет тестировать соединения in vivo. Скрининг на наркотики с помощью этого метода обеспечивает быстрый и недорогой способ выявления гетерохроматина содействия препараты, которые могут иметь благотворное влияние в терапии рака. Выявление соединений, способствующих образованию гетерохроматина, также может привести к открытию эпигенетических механизмов развития рака.

Этот протокол был успешно использован для проверки соединений, которые способствуют образованию гетерохроматина в Drosophila, который является эффективным и недорогим in vivo системы для разработки лекарственных средств(рисунок 1). Мы проверили маломолекулярной библиот?...

Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Дрозофила является широко используемой экспериментальной моделью, подходящей для скрининга препаратов с потенциальными приложениями для терапии рака. Здесь мы описываем использование drosophila пестрые фенотипы цвета глаз в качестве метода для скрининга малых молекул соединений, которые способствуют образованию гетерохроматина.

Метод скрининга для выявления гетерохроматина-пропагандирующих наркотиков с использованием дрозофилы

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

В настоящее время нет препаратов, которые хорошо зарекомендовали себя в содействии формированию гетерохроматина. Здесь мы представляем простой и эффективный метод выявления небольших молекул соединений, которые способствуют этому процессу. Наш протокол скрининга обеспечивает простую, недорогую, простую в использовании систему in vivo для идентификации наркотиков, пропагандирующих гетерохроматин.Выявление соединений, которые способствуют формированию гетерохроматина может привести к открытию механизмов рака, что починка и терапии рака. Эта экономически эффективная была измерена для выявления гетерохроматина поощрения соединений в Drosophila также может быть использован для подсчета формы хитов, как это превентивная мера для самого высокого клеточного пула клеточного скрининга. Наш протокол скрининга также может быть полезен для быстрых пилотных экранов, так как эта система Drosophila TranSheet производит пестрый фенотип цвета глаз, который обратно коррелирует с количеством гетерохроматина, присутствуют на лету.Помочь продемонстрировать процедуру будет Кенни Дао, студент-студент из нашей лаборатории. После выявления и подготовки библиотеки наркотиков для скрининга с использованием соответствующего растворителя, и желаемой концентрации, крест трех самцов мух с тремя или более девственными самками мух в 25 на 95 миллиметров пищевой флакон. С девятью миллиметрами стандартной дрозофилы пищевой среды.Настройка трех реплик флаконов для каждого препарата. Добавьте один контрольный флакон для экрана. И позволить мухам откладывать яйца в течение двух дней при комнатной температуре.На второй день креста, анестезировать мух с коротким взрывом углекислого газа. И отбросить родителей летит в бутылке, содержащей 70% этанола. Далее разбавляют каждое лекарственное соединение из первоначального запаса для участия в микро-молярной конечной концентрации в 33%DMSO в воде.И добавить 60 микролитров препарата, или контроль 33%DMSO только, на вершине мухи пищи. Затем подтвердите, что в флаконах нет родительских мух. И добавьте раствор препарата в соответствующие флаконы.Через два дня после появления мух F1, передача анестезированных мух из одного флакона в то время, на пористой вскрытой площадке с углекислым газом фильтрации через из-под фильтровальной бумаги. Под рассечением микроскопа, изучить каждую всю муху, выявление всех гетерозиготных самцов по их отсутствию кудрявый о-доминирующей фигурные фенотип крыла. Оценка цвета глаз каждого гетерозиготного самца по шкале от одного до пяти.С одной оценкой присваивается менее 5%красный рассеянный глаз общей площади поверхности. Добавить два балла мух с 6 до 25%красное пятно глаз общей площади поверхности. Три мухи с 26 до 50%красное пятно глаз общей площади поверхности.Четыре мухи с 51 до 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. И пять мух с более чем 75%красное пятно глаз общей площади поверхности. Затем вычислите средний цветовой индекс всех самцов с каждого флакона, забитого в трипликате.Чтобы подтвердить, что соединения действительно способствуют формированию хетерохроматина, можно выдать другой метод проверки, такой как западный blotting. В этом репрезентативном эксперименте, небольшая библиотека молекулы наркотиков, онкология набор 3, который состоит из 97 FDA уполномоченных онкологических препаратов, был проверен с помощью штамма DX1 Drosophila Меланогастер. Согласно скрининговому анализу, метотрексат, закодированный как E7 в библиотеке, вызвал наибольшее изменение штамма Dx1.Предполагая, что метотрексат может быть наиболее перспективным гетерохроматин содействия препарат для будущей терапии рака целевых. Для дальнейшего подтверждения того, что это соединение способствует трансформации гетерохроматина, западные данные пятно было выполнено. Демонстрация регуляции гетерохроматина форматина связанного белка, триметилирования H3K9 и проверки результатов скрининга.Критическим шагом является оценка цвета глаз каждого из белых 11-18 DX1 гетерозиготных самцов мух по шкале от одного до пяти в соответствии с предопределенным маршрутом исследования. Мы можем использовать западные помарки или иммуностимуляторы для подтверждения попаданий. Открытие соединений, которые, как предполагается, способствуют формированию гетерохроматина, также может привести к открытию IV генетического механизма развития рака и клинических испытаний у пациентов.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Скрининг Хлопковых Генотипов для Сопротивления Нематод Рениформ

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Высокопроизводительная ДНК плазменный мультиплексирование и трансфекция с использованием акустической технологии нанодозирования

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Идентификация циркулярных РНК с использованием секвенирования РНК

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Использование Дрозофилы S2 клетки для живой визуализации клеточного отдела

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Скрининг и идентификация РНК Silencing супрессоров от секретных эффектов растительных патогенов

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Идентификация рецепторов поверхности клетки используя Геном-Шкала CRISPR/Cas9 Генетические экраны

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...