Name: a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

Vi tackar J. Birchler, E. Bach och Bloomington Drosophila Stock Center för olika Drosophila stammar; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program för onkologi Set små molekyl läkemedelsbibliotek; UCSD grundutbildning studenter inklusive Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, och Alex Chavez. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av ett forskningsanslag från American Thoracic Society till J.L. och finansiering från NIH: R01GM131044 till W.X.L.

1. Förberedelse av läkemedelsbibliotek
<ol><li>Identifiera och förbereda ett läkemedelsbibliotek som ska screenas med hjälp av lämpligt lösningsmedel vid önskad koncentration (t.ex. 10 mM i DMSO). OBS: Ett specifikt exempel för ett läkemedelsbibliotek är Onkologi Set III från National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Föreningar i denna uppsättning tillhandahålls som 20 μL vid 10 mM i 100% DMSO i två 96-brunnPP U-botten plattor och lagras vid -20 °C. NCI Plate kartor,...

<ol>
	<li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+cancer.">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li><li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals.">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).</li><li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function.">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li><li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression.">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer.">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer.">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li><li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li><li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays.">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing.">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability.">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li><li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes.">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li><li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug.">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).</li><li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Heterochromatin+Protein+1+(HP1)+to+cancer+progression.">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li><li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin:+Guardian+of+the+Genome.">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing.">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth.">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li></ol>

Heterokromatin är en kondenserad form av DNA som spelar en central roll i regleringen av genuttryck. Det blir allt mer erkänt i cancer och kan fungera som ett potentiellt mål för cancerbehandling15,16,17,18. Små molekyler föreningar används ofta i läkemedelsutveckling på grund av fördelar inom tillverkning, konservering, och metabolism i mänskliga kroppar. För att identifiera hetero...

Heterokromatin är en kondenserad form av DNA som spelar en central roll i genuttryck, i regleringen av kromosomssegregering under celldelning, och för att skydda mot genominstabilitet1. Heterokromatin har ansetts vara en genförtryck regulator och för att skydda kromosom integritet under cell mitosis2,3. Det är förknippat med di- och tri-metylering av histon H3 lysin 9 (H3K9me) under härstamning åtagande4,5. Dessutom anses rekrytering av heterokromatinprotein 1 (HP1) kromodomänproteiner också vara förknippade med heterokromatin och epigenetiskt förtryck av genuttryck6. Dessa proteiner är viktiga komponenter och markörer för heterokromatinbildning.
Eftersom genomisk instabilitet gör det möjligt för celler att förvärva genetiska förändringar som främjar cancerframkallande ämnen, heterokromatin blir mer erkänd i cancerutveckling och kan vara inriktade på cancerbehandling7,8. För närvarande finns det inga läkemedel som är väl etablerade för att hjälpa heterokromatinbildning. Här presenterar vi en enkel och snabb men effektiv metod för screening av små molekylföreningar som främjar heterokromatinbildning. Screeningen görs genom att behandla Drosophila med ett bibliotek av små molekyler droger. Denna metod drar nytta av en brokig ögonfärg fenotyp i DX1Drosophila stam som påverkas av heterochromatin nivåer. DX1 flugor innehåller en tandem array av sju P [lac-w] transgenes, som har det brokiga uttrycket/depressionen beroende på heterochromatinisering, därför återspeglar variationen av variegation i ögonfärgen heterokromatinnivån. Specifikt kan ökande heterokromatin detekteras av den ökande andelen brokiga ögonfärg (vitt öga). Tvärtom skulle minskande heterokromatin upptäckas av den ökande andelen av P [lac-w] transgenuttryck (röda ögon)9,10,11,12.
Därför drar vi nytta av detta Drosophila transgensystem som producerar en brokig ögonfärg fenotyp eftersom dess uttryck är direkt korrelerade till mängden heterokromatin närvarande. Vid upptäckt av föreningar som misstänks främja heterokromatin bildning, kan vi bekräfta denna misstanke med andra metoder såsom västra blot. Dessa heterokromatin-främja ämnen kan vidareutvecklas för kliniska prövningar på patienter i framtiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td></td>
			<td>DX1 strain</td>
			<td>DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food media</td>
			<td>UCSD fly kitchen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate</td>
			<td>NCI drug library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screening method for identification of heterochromatin-promoting drugs using drosophila

Drosophila är en utmärkt modell organism som kan användas för att skärmen föreningar som kan vara användbara för cancerbehandling. Den metod som beskrivs här är en kostnadseffektiv in vivo-metod för att identifiera heterokromatin-främja föreningar med hjälp av Drosophila. Den Drosophila's DX1 stam, med en brokig ögonfärg fenotyp som återspeglar omfattningen av heterokromatin bildning, vilket ger ett verktyg för en heterochromatin-främja drogskärm. I denna screeningmetod kvantifieras ögonvariationen baserat på ytan av röda pigmentering som upptar delar av ögat och poängsätts på en skala från 1 till 5. Screeningmetoden är enkel och känslig och möjliggör testning av föreningar in vivo. Läkemedelsscreening med denna metod ger ett snabbt och billigt sätt att identifiera heterokromatin-främjande läkemedel som kan ha positiva effekter i cancer therapeutics. Identifiera föreningar som främjar bildandet av heterokromatin kan också leda till upptäckten av epigenetiska mekanismer för cancerutveckling.

Detta protokoll användes framgångsrikt för att screena föreningar som främjar heterokromatinbildning i Drosophila, som är ett effektivt och billigt in vivo-system för läkemedelsutveckling (figur 1). Vi screenade en liten molekyl läkemedelsbibliotek, Onkologi Set III, som består av 97 FDA auktoriserade onkologi läkemedel, med hjälp av DX1 stam av Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultaten för ett betyda...

Watch this Scientific Journal Video about A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila at JoVE.com

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila är en allmänt använd experimentell modell som lämpar sig för screening av läkemedel med potentiella tillämpningar för cancerbehandling. Här beskriver vi användningen av Drosophila brokiga ögonfärg fenotyper som en metod för screening små molekyler föreningar som främjar heterokromatin bildning.

En screeningmetod för identifiering av heterokromatinfrämjande läkemedel med drosofila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

För närvarande finns det inga läkemedel som är väletablerade i att främja heterochromatin bildas. Här presenterar vi en enkel och effektiv metod för att identifiera små molekyler föreningar som främjar denna process. Vår screening protokoll ger en enkel, billig, lätt att följa in vivo system för heterochromatin-främja läkemedelsidentifiering.Identifiera föreningar som främjar heterochromatin bildning kan leda till upptäckten av mekanismer för cancer som laga och cancer terapi. Detta kostnadseffektiva har mätts för att identifiera heterochromatin-främja föreningar i Drosophila kan också användas för att räkna form träffar eftersom det är en förebyggande åtgärd till en högsta cell pool av cellscreening. Vår screening protokoll kan också vara användbart för snabb pilot skärmar som detta Drosophila TranSheet systemet producerar en brokig ögonfärg fenotyp som är omvänt korrelerade till mängden heterokromatin som finns i flugan.Att hjälpa till att visa förfarandet kommer att Kenny Dao, en undergrad student från vårt laboratorium. Efter att ha identifierat och förbereda ett läkemedelsbibliotek för en screening med hjälp av ett lämpligt lösningsmedel, och den önskade koncentrationen, korsa tre hanflugor med tre eller fler jungfruliga kvinnliga flugor i en 25 av 95 millimeters matflaska. Med nio millimeter av standard Drosophila matmedium.Ställ in tre replika injektionsflaska för varje läkemedel. Lägg till en kontrollflaska för skärmen. Och låt flugorna lägga ägg i två dagar i rumstemperatur.På dag två av korset, bedöva flugorna med en kort explosion av koldioxid. Och kasta föräldern flyger i en flaska som innehåller 70%etanol. Nästa, späd varje läkemedel förening från det ursprungliga beståndet att närvara mikro molar slutlig koncentration i 33%DMSO i vatten.Och tillsätt 60 mikroliter av läkemedlet, eller kontrollen 33%DMSO ensam, ovanpå flugmaten. Bekräfta sedan att inga föräldraflugor är närvarande inom injektionsflaskan. Och tillsätt läkemedelslösningen till lämpliga injektionsflaska.Två dagar efter F1-flugorna dyker upp överför du sövda flugor från en injektionsflaska i taget på en porös dissekeringsdyna med koldioxidfiltrering genom underifrån filterpapperet. Under en dissekera mikroskop, undersöka varje hela flugan, identifiera alla heterozygous hanar av deras brist på lockigt o-dominerande lockig vinge fenotyp. Betyg ögonfärgen på varje heterozygous hane på en skala från ett till fem.Med en en poäng tilldelas en mindre än 5%röda spridda ögat totala yta. Lägg till en två poäng till flugor med en 6 till 25%röda fläckögon total yta. En tre till flugor med en 26 till 50%röda fläckögon totala yta.En fyra till flugor med en 51 till 75%röda fläckögon totala yta. Och en fem flugor med en större än 75% röda fläcken öga total yta. Beräkna sedan medelvärdet färgindex för alla hanar från varje injektionsflaska poäng i tre exemplar.För att bekräfta att föreningarna verkligen främja heterochromatin bildning, en annan valideringsteknik, såsom västra blotting, kan utföras. I detta representativa experiment, en liten molekyl läkemedelsbibliotek, onkologi som 3, som består av 97 FDA auktoriserad onkologi läkemedel, screenades med hjälp av DX1 stam av Drosophila Melanogaster. Enligt screening analysen, metotrexat, kodad som E7 i biblioteket, orsakade mest variation inom Dx1 stam.Tyder på att metotrexat kan vara den mest lovande heterochromatin-främja läkemedel för framtida cancer riktad terapi. För att ytterligare bekräfta att denna förening främjar heterochromatin omvandling, utfördes västra blot data. Demonstrera upp reglering av heterochromatin formatin associerade protein, H3K9 trimetylering, och validera screening resultat.Det kritiska steget är scoring ögonfärgen på var och en av de vita 11-18 DX1 heterozygous hanen flyger på en skala från ett till fem enligt en förutbestämd studie väg. Vi kan använda western blots eller immunfärgning för att bekräfta träffarna. Upptäckten av föreningar som misstänks främja heterokromatin bildas kan också leda till upptäckten av IV genetisk mekanism för cancer utveckling och kliniska prövningar på mänskliga patienter.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening av bomull genotyper för reniform Nematodresistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Hög genomströmning DNA plasmid Multiplexing och transfektion med akustisk Nanodispenseringsteknik

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifiering av cirkulär RNAs med RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Användning av Drosophila S2-celler för levande avbildning av cell delning

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening och identifiering av RNA-ljuddämpningssuppressorer från utsöndrade effektdämpare av växtpatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Cell Surface Receptor Identification Med hjälp av genomskala CRISPR/Cas9 Genetiska skärmar

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...