Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

ونود أن نشكر جان كلود والسر من مركز التنوع الوراثي في زيوريخ على مشورة الخبراء الحاسمة في المرحلة المبكرة من هذا المشروع. تم دعم العمل في مختبر فيرمير من خلال منحة الأستاذية SNF (PP00P3_157524) ومنحة معدات R'EQUIP (316030_164086) من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF) الممنوحة لـ JEMV.

1- استنساخ الجين المتحول وإنتاج الخطوط المحورة وراثياً والاختيار
<ol><li>استنساخ المروج من الاختيار في ناقلات الإدخال المناسبة. استخدام طريقة الاستنساخ المستندة إلى إعادة الجمع(جدول المواد)وإعادة دمج المروجين في pDONRP4-P1r. استنساخ RPL18 (مع علامة تقارب أو بروتين الفلورسنت من اختيار) باس...

التحقق من نمط تعريب RPL18 حاسمة لتجنب سوء تفسير البيانات من أي تجربة TRAP هو نمط التعبير السليم للوحدة الفرعية riبومال الموسومة. لذلك ، فإن دمج GFP كعلامة epitope إلى RPL18 يسمح بأناقة كبيرة بالتحقق من نمط التعبير المطلوب وعلى التوالي ، والسحب من الكسر المتعدد الأجزاء من نفس الأنسجة. يتبع جي?...

وبدافع من التطبيق المتزايد لتقنيات التسلسل من الجيل التالي، يمكن زيادة الاستبانة المكانية في البيولوجيا الإنمائية. تهدف الدراسات المعاصرة إلى تشريح الأنسجة وصولاً إلى أنواع الخلايا المتخصصة، إن لم يكن بخلية واحدة المستوى1،,2،,3،,4. ولتحقيق هذه الغاية، تم ابتكار عدد كبير من الطرق المختلفة على مدى السنوات الخمسين الماضية (انظر الشكل 1A)5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15.
وقد تم العديد من الأدوات في علم النبات التكيف من التقنيات التي كانت رائدة في مجال البحوث الحيوانية. وليس هذا هو الحال بالنسبة للطريقة التي نقدمها بالتفصيل هنا. في عام 2005، مجهزة خلفية قوية في ترجمة البروتين، مختبر بيلي سيريس المنصوص عليها لهندسة البروتينات riبوم لتنقية تقارب لاحقة16. وهكذا، فإنها يمكن أن تجنب التنميط متعدد السمات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، والذي يقوم على ultracentrifugation مع تدرج السكروز وكان يستخدم لتقييم ترجمة الريبوسوم منذ 1960s17،18. ومنذ ذلك الحين يشار إلى الأسلوب على أنه تنقية تقارب الريبوسرية الانتقالية (TRAP)16. بعد نجاح دراسات الترجمة في النباتات، Heiman وآخرون تكييفها TRAP للحيوانات19 وغيرها وسعت تطبيقها إلى الخميرة20، Drosophila21، زينوبوس22 وحمار وحشي23،24.
على الرغم من أن التعديل الجيني للنظام النموذجي هو شرط أساسي لـ TRAP ، الذي يحد من تطبيقه على الأنواع القابلة للتحول الوراثي ، يمكن للمرء في الوقت نفسه تسخير هذا الاعتراض لاستهداف مجموعات فرعية من الخلايا ذات أهمية خاصة ويصعب للغاية عزلها عن الأنسجة السليمة / الجهاز25 (على سبيل المثال ، الخلايا التشفية المتفرعة للغاية في دماغ فأر أو الهيفاي الفطري في الأنسجة النباتية المصابة). في النباتات ، يتم الاحتفاظ بجميع الخلايا في مكانها عبر جدران الخلايا التي تشكل أساس الهيكل العظمي الهيدروستاتيكي26. لتحرير خلية نباتية من هذه المصفوفة ، قام العلماء إما بقطع الخلية فعليًا من الأنسجة المحيطة بها من خلال إجراء عملية إزالة الميكروبات بالليزر (LCM)27 أو إجراء هضم أنزيمي لجدران الخلية28. من بين الخلايا الأخيرة، ما يسمى protoplasts، يتم تسمية السكان من الفائدة الفلورسنت ويمكن فصلها عن طريق فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS)7. LCM يتطلب عادة عينة لتكون ثابتة وجزءا لا يتجزأ من الشمع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تدهور نوعية الحمض النووي الريبي29. الأساليب المستندة إلى FACS تنتج الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، ولكن عملية protoplasting نفسها تدخل اختلافات في التعبير الجيني30 والأنسجة ذات جدران الخلايا الثانوية المعدلة والسميكة من الصعب علاجها. وعلاوة على ذلك، يفترض العديد من العمليات التنموية في النباتات أن تعتمد على إشارات تنتقل ميكانيكيا، وبالتالي سلامة جدار الخلية ذات أهمية قصوى31. طريقتان، تستخدمان اختصاراً للتحايل على عزل الخلايا من خلال العمل على مستوى النوى، هما الفرز النووي المنشط للفلورسينس (FANS) وعزل النوى الموسومة بأنواع خلايا محددة (INTACT). كما هو الحال في TRAP ، فإنها تستخدم المروجين نوع الخلية الخاصة لوضع علامة على النوى ، التي تحصل في وقت لاحق إثراء عن طريق الفرز أو سحب إلى أسفل ، على التوالي8،15. التحدي الرئيسي لجميع هذه النهج هو الحصول على ما يكفي من المواد الحمض النووي الريبي من مجموعات فرعية من الخلايا في الأنسجة. كما يلتقط TRAP سوى جزء صغير من الحمض النووي الريبي الخلوي، جمع عينة هو عنق الزجاجة كبيرة. ولذلك، هناك حاجة إلى بروتوكولات إعداد المكتبة الحساسة بشكل خاص لإنتاج بيانات عالية الجودة من كميات مدخلات منخفضة.
منذ إنشائها، وقد استخدمت TRAP إما في تركيبة مع microarrays الحمض النووي أو، كما انخفضت تكاليف التسلسل بشكل كبير في السنوات الأخيرة، RNA-seq10،32،33. وقد تم بالفعل توضيح العديد من الأسئلة البحثية كما تمت مراجعتها في Sablok et al.34. ونحن مقتنعون بأن المزيد من التقارير ستتبع في السنوات المقبلة كما تقنية متعددة جدا عند الجمع بين المروجين مختلفة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. في نهاية المطاف، سيتم ذلك حتى بطريقة لا يمكن اختزالها، ويمكن دمجها مع التحقيق في رد فعل النبات على العديد من عوامل الإجهاد الحيوي واللاأحيائي. بالإضافة إلى ذلك ، حيث لا تتوفر خطوط معدلة مستقرة ، تم استخدام أنظمة التعبير عن الجذر المشعر بنجاح أيضًا لتنفيذ TRAP في الطماطم وmedicago35،36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> الشكل 1: ترجمة تنقية التقارب الريبوسومي (TRAP) تكمل محفظة تحليل "omics". A. يمكن تحقيق زيادة مستويات الدقة التحليلية، وصولا إلى وحدة واحدة أو حتى دقة تحت الخلية من خلال عدد كبير من الأساليب أو تركيبات منها. ويقدم هذا المخطط لمحة عامة عن الأدوات المتاحة حاليا في المجال النباتي والحيواني. يمكن تحقيق جمع الأنسجة في دقة الخلوية من خلال بروتوكولات مثل LCM أو FACS ، والتي يتم اقترانها بعد ذلك بالنسخ القياسي أو تحليل التنميط / الترجمة المتعدد. TRAP وسليمة دمج كل من التقاط الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي لأنها تقوم على العلامات epitope. ومع ذلك ، عينات سليمة نواة الخلية فقط ويشكل ، وبالتالي ، حالة خاصة من تحليل النسخ. رمز أرنب صغير علامات الأساليب المطورة حديثا في مجال الحيوان: في حين أن SLAM-ITseq وFlura-seq تعتمد على التتار الأيضي من الحمض النووي الريبي الوليد مع قواعد uracil المعدلة في الخلايا التي تعبر عن الإنزيم المتساهل، الشريحة-seq يجعل استخدام شريحة الزجاج المغلفة مع الباركود الحمض النووي التي توفر المعلومات الموضعية في النطاق الخلوي. ويتبع نهج وضع علامات القرب في APEX-seq لأخذ عينات RNAs في مقصورات دون خلوية محددة. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة الاستبانة كثيرا ما تتطلب توليد مواد معدلة وراثيا (علامات نجمية) ومن ثم تستخدم هذه الأساليب في الغالب للأنواع النموذجية. TRAP مناسب بشكل خاص لدراسات علوم النبات التي تنطوي على جدار الخلايا (CW) أو إشارات ميكانيكية وكذلك أنواع الخلايا التي يصعب إطلاقها من مصفوفة CW الخاصة بهم. ب. مفصلة الخطوات الرطب مختبر الإجراء TRAP: تزرع الشتلات التي تعبر عن بروتين riبوم الموسومة GFP في أنواع الخلايا المتميزة (مثل endodermis الجذر) على أطباق بيتري لمدة سبعة أيام والمواد الجذرية التي يتم حصادها عن طريق تجميد المفاجئة. يتم جمع عينة التحكم في الحمض النووي الريبي بالكامل من مستخلص النفط الخام المتجانس قبل أن يُسقط الحطام عن طريق الطرد المركزي. يتم إضافة الخرز المغناطيسي المضاد لـ GFP إلى المستخلص المنفّر لإجراء الترسيبات المناعي. بعد الحضانة وثلاث خطوات غسل ، يتم الحصول على الحمض النووي الريبي المرتبط بالبولي بعض (TRAP / POLYsome RNA) مباشرة عن طريق استخراج الفينول الكلوروفورم. LCM: الليزر التقاط microdissection، FACS / FANS: خلية تنشيط الفلورسينس / الفرز النووي، APEX-seq: طريقة تقوم على ascorbate peroxidase المهندسة، سليمة: عزل النوى الموسومة في أنواع خلايا محددة، SLAM-ITseq: thiol (SH) المرتبطة alkylation لتسلسل التمثيل الغذائي من الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة، فلورا-seq: فلوروراسيل المسمى تسلسل الحمض النووي الريبي (خلق مع Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الهدف من هذه المقالة هو توفير وصف مفصل لأسلوب TRAP، لتسليط الضوء على الخطوات الهامة وتوفير التوجيه لأسلوب إعداد مكتبة ممكن.
وستتألف تجربة TRAP العامة أساسا من الخطوات التالية (انظر أيضا الشكل 1باء):(1) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ بناء العلامات الريبوسومية، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وتزايد البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم يُحدّد البناء، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وزراعة البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم لوضع العلامات على الخلايا. (2) التنقية المناعية بما في ذلك تجانس الأنسجة وتطهير مستخلص النفط الخام، وغسل النحل وتنقية المناعة، وخطوات الغسيل؛ (3) استخراج الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة؛ و(4) إعداد المكتبة.
وقد جذر Arabidopsis نظام نموذجي لدراسة تطوير النبات منذ عرضه كمصنع نموذجي37,38. هنا ، يتم عرض تطبيق TRAP في سياق تطوير الجذر الجانبي النباتي. في النباتات ، يعتمد تراكم نظام الجذر بأكمله على تنفيذ هذا البرنامج وبالتالي فهو مهم جدًا لبقاء الكائن الحي39. في Arabidopsis، تنشأ الجذور الجانبية من أنسجة الدراجة المحيطة التي تتواجد بجوار أوعية xylem وبالتالي يطلق عليها اسم xylem pole pericycle (XPP ؛ انظر الشكل 2C)40. بعض خلايا XPP ، والتي تقع في عمق الجذر ، والحصول على هوية الخلية مؤسس ، وعلى الزناد الهرمونية المحلية ، والبدء في الانتشار عن طريق تورم وتقسيم anticlinally41. ومع ذلك ، بسبب وجود مصفوفة جدار الخلية جامدة ، وهذه العملية تمارس الإجهاد الميكانيكي على الأنسجة المحيطة بها. على وجه الخصوص ، يتأثر endodermis التجاوزي ، كما هو الحال في طريق محور نمو الجذر الجانبي42،43،44. في الواقع ، فإن تشكيل بريمورديوم حديثا يجب أن تنمو من خلال الخلية endodermis المبالغ فيها(الشكل 2C2)في حين يتم دفع الخلايا القشرة والبشرة جانبا لprimordium لتظهر أخيرا45،46. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة في مختبرنا أن endodermis يساهم بنشاط لاستيعاب انتشار في pericycle. حظر المستهدفة من الإشارات الهرمونية endodermal كافية لمنع حتى الانقسام الأول جدا في خلايا XPP47. وبالتالي، الاتصالات pericycle-endodermis يشكل نقطة تفتيش مبكرة جدا لتطوير الجذر الجانبي في Arabidopsis. ومع ذلك، لا يُعرف كيف يتم تنفيذ هذا الكلام المتقاطع. لكشف هذا اللغز، اخترنا نهج TRAP-seq لاستهداف XPP والخلايا endodermal. لإثراء للخلايا في برنامج الجذر الجانبي، ونحن تحاكي الزناد الهرموني عن طريق تطبيق خارجي تناظرية الأوكسين (1-حمض النفتاليناستيك، NAA)48،والتي سمحت في الوقت نفسه لحل مؤقتا المرحلة الأولية من تشكيل الجذر الجانبي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

في هذه المقالة، نعطي تعليمات عملية للحصول على بيانات الترجمة من أنواع مختلفة من الخلايا الجذرية العربية dopsis thaliana عبر ترجمة التنقية تقارب الريبوسر (TRAP) ومتتالية الأمثل إعداد مكتبة منخفضة الإدخال.
كمادة البدء، ونحن توظيف خطوط النبات التي تعبر عن GFP الموسومة بروتين riبومRPL18 بطريقة محددة نوع الخلية عن طريق استخدام المروجين كافية. قبل المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي ، يتم تجميد الأنسجة ، مما يحافظ على سلامة الأنسجة ويسمح في الوقت نفسه بتنفيذ دراسات السلسلة الزمنية بدقة زمنية عالية. وتجدر الإشارة إلى أن هياكل جدار الخلية لا تزال سليمة، وهو عيب رئيسي في الإجراءات البديلة مثل الأساليب القائمة على فرز الخلايا المنشطة للفلورسينس والتي تعتمد على الأنسجة المصممة لعزل مجموعات الخلايا المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يلزم تثبيت الأنسجة كما هو الحال في تقنيات التقاط الميكروديزالقسمة بالليزر ، والتي تسمح بالحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة.
ومع ذلك، فإن أخذ العينات من المجموعات الفرعية للخلايا وعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالبوليبعض فقط يحد بشدة من غلة الحمض النووي الريبي. ولذلك، من الضروري تطبيق أساليب إعداد المكتبة الحساسة بما فيه الكفاية من أجل الحصول الناجح على البيانات من قبل RNA-seq.
يقدم TRAP أداة مثالية لأبحاث النبات حيث أن العديد من العمليات التنموية تنطوي على مسارات إشارات ميكانيكية ذات صلة بجدار الخلية. استخدام المروجين لاستهداف مجموعات محددة من الخلايا هو سد الفجوة بين الجهاز ومستوى الخلية الواحدة التي تعاني بدورها من دقة قليلة أو تكاليف عالية جدا. هنا، نطبق TRAP لدراسة الاتصالات الخلية الخلية في تشكيل الجذر الجانبي.

ولتقييم الجودة، ينبغي بحث الإجراء المذكور أعلاه في عدة خطوات وسيطة: التحقق من صحة نمط التعبير في بلانتا، ومراقبة جودة الحمض النووي الريبي المتعدد الخصائص المعزول، فضلا عن المكتبات النهائية. يمكن إجراء qRT-PCR باستخدام جينات علامة معروفة ، بالإضافة إلى ذلك ، لتأكيد الاستجا?...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) يوفر إمكانية تشريح البرامج التنموية مع الحد الأدنى من معالجة الأعضاء والأنسجة. ينتج البروتوكول عن الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا المستهدفة ببروتين فلورسنت أخضر (GFP) يسمى وحدة فرعية من الريبوزيوم. تكشف أدوات التحليل المصب، مثل qRT-PCR أو RNA-seq، عن ملفات تعريف التعبير الخاصة بنوع الأنسجة والخلايا.

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

مع TRAP، يمكننا التحقيق في المعالجة التنموية بدقة خلوية. نستخدم المروجين من نوع الخلية لقيادة وحدة فرعية الريبوسومية الموسومة ، ومن هناك يمكننا عزل الحمض النووي الريبي المتعدد. هذا البروتوكول ينتج RNA عالية الجودة ، ولكن بكميات محدودة للغاية ، لذلك ، هناك حاجة إلى الأساليب المتخصصة في المدخلات المنخفضة للغاية لإنتاج مكتبات RNA عالية الجودة بشكل موثوق.TRAP هو أداة مثالية للبحوث النباتية، لأن العديد من العمليات التنموية تعتمد على مسارات الإشارة الميكانيكية المتعلقة بجدار الخلية. نحن نستخدم TRAP لدراسة خلية اتصال الخلية في تشكيل الجذر الجانبي. كما ثبت الحصول على نوعية جيدة RNA ليس على التوالي إلى الأمام كما كنا نتوقع، ونحن نأمل أن هذا التعليم الفيديو خطوة بخطوة سوف تزيد من تطبيق TRAP وتساعد على تعزيز هذه التقنية القوية.لتعقيم خطوط homozygous نشر، ونشر أقل من 300 ميكرولتر من البذور بالتساوي على 12 في 12 سم مربع أطباق بيتري، وكومة الأطباق على 60 لتر desiccator. بعد تعقيم الغاز بين عشية وضحاها، والسماح للغاز يتبخر قبل جمع البذور في أنبوب تخزين 50 ملليلتر. قبل الطلاء، تمييع البذور المعقمة مع 0.1٪ أجار للحصول على ملليلتر واحد من مزيج البذور الممدودة لكل لوحة.لطبقة مزيج البذور، استخدم أغطية طبق بيتري مربعة لإنشاء حامل قالب مغلفة لغرس ثلاثة صفوف من البذور لكل لوحة، ووضع لوحات أجار فارغة في حامل القالب. توزيع ملليلتر واحد من البذور imbibed بالتساوي على ثلاثة صفوف من لوحات. ووضع لوحات معالجتها في أكوام في تدفق لارينار، حتى البذور جافة.عندما تلتصق البذور بسطح أجار، أغلق الأغطية وختم كل لوحة بشريط ميكروبور. لعلاج خارجي من جذور arabidopsis مع عامل من الفائدة ، وإعداد 1.5 إلى اثنين من سنتيمتر واسعة ، 10 سنتيمترا ، شرائط من ورق الأنسجة. نقع ورقة الأنسجة في 10 naa micromolar، واستخدام ملاقط لتطبيق شريط من الورق الأنسجة على كل صف من الجذور.ثم، اضغط بلطف خارج أي فقاعات الهواء، وإفراغ السائل الزائد من لوحة، قبل وضع علامة على لوحة مع الوقت. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم ملقط لإزالة شرائح الورق من الأنسجة بعناية من كل لوحة دون فصل الجذور، واستخدم شفرة جراحية لقطع مرة واحدة في الصف على طول تقاطع جذر التصوير، في ضربة واحدة محددة. استخدام ملاقط لانتقاد على طول جذور كل صف، لجمع جذور في ثلاث حزم.وتفرغ الجذور إلى أنبوب 50 ملليلتر مملوء بالنيتروجين السائل، لتجميد المفاجئة. عندما تم جمع كل من عينات الجذر لكل علاج، decant النيتروجين السائل الزائد باستخدام غطاء أنبوب لمنع الجذور من الانسكاب. ووضع الأنبوب في وعاء doer، لتخزين 80 درجة مئوية.لطحن الأنسجة والتجانس، وارتداء قفازات القطن تحت قفازات مختبر القياسية، وإضافة PMSF إلى العازلة استخراج متعددةsome. إفراغ عينة الأنسجة في هاون يحتوي على النيتروجين السائل، واستخدام آفة المبردة لطحن بعناية الأنسجة حتى تظهر جميع المواد كمسحوق أبيض. عندما تم كل من الأنسجة الأرض، إضافة خمسة ملليلتر من العازلة استخراج متعددة إلى العينة، وخلط بسرعة شظايا الأنسجة المجمدة مع مسحوق قبل تجميد العازلة.بمجرد أن يمكن نقل الخليط ، إفراغ الطين إلى مزج الزجاج على الجليد ، واستخدام مليلترين إضافيين من العازلة استخراج متعددة التخصصات لشطف هاون وحشرات. طحن الطين يدويا حتى استخراج متجانسة. ثم، صب استخراج الجذر الخام في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر على الجليد، ومعالجة العينة التالية كما هو موضح.بالنسبة لمجموع جمع الحمض النووي الريبي، قم بنقل 200 من جمل ميكرولتر من كل عينة خام إلى أنابيب فردية نظيفة سابقة التبريد تحمل اسم microcentrifuge. لإزالة جدران الخلايا، والحطام، والعضيات الكبيرة، الطرد المركزي العينات وdeconant إلى أنابيب مخروطية جديدة، قبل التبريد للطرد المركزي الثاني. في حين أن الأنابيب تدور، aliquot 60 ميكرولتر من الخرز GFP المغناطيسي لكل عينة، في أنبوب 1.5 ملليلتر.ووضع الأنبوب على موقف مغناطيسي، لتسهيل إزالة فائقة. ثم، وغسل الخرز مرتين في ملليلتر واحد من غسل الباردة العازلة في غسل، وإعادة تعليق الخرز في 60 ميكروليتر من المخزن المؤقت غسل لكل عينة. مباشرة بعد الطرد المركزي، ديسابيرت مسح في أنابيب 15 ملليلتر المسمى، وإضافة 60 ميكرولترات من الخرز غسلها إلى كل عينة.ثم، ضع كل العينات أفقيا في دلو الثلج، لمدة ساعتين حضانة مع هزاز. في نهاية الحضانة، وجمع الخرز على موقف مغناطيسي على الجليد، وإضافة PMSF إلى العازلة استخراج البوليسوم المتبقية. بعد التخلص من المابات، إضافة ما يقرب من خمسة ملليلترات من العازلة استخراج متعددة إلى العينات، وإعادة تعليق الخرز داخل العينات مع إمالة لطيف.صخرة العينات لمدة 15 دقيقة على شاكر على الجليد، تليها اثنين من يغسل مع عازلة غسل الطازجة على المغناطيس، كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، قم بنقل العينات في ملليلتر واحد من عازلة الغسيل، إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. وجمع الخرز مرة أخرى على موقف المغناطيسي، لإزالة كل من افرا.ثم ضع الأنابيب على الجليد حتى تتم معالجة جميع العينات. لإعادة تجهيز اللوازم المعملية، أولاً، شطف جميع المعدات في النفايات الكيميائية. غسل اليد قذائف الهاون، الأوبئة، والمجانسة مع الصابون، قبل شطف كل صك بدقة.بعد ذلك، ضع المعدات في حاوية آمنة من الحرارة، واخبز المواد بين عشية وضحاها في أكثر من 220 درجة مئوية. فرشاة جميع أنابيب الطرد المركزي نظيفة مع المنظفات، قبل وضع الأنابيب على علبة قابلة لأتمتة مع حافة وغطاء الدخان. صب ملليلتر واحد من بيريوكاربوينت دييثيل السائل واحد لتر من محلول المياه ديونيد على الأنابيب لمدة ثلاث إلى 18 ساعة.ثم، وجمع الحل قبل تعقيم صينية من الأنابيب في الأوتوكلاف. هنا، تظهر النباتات التمثيلية مع إشارات GFP. مضادة تلطيخ مع يوديد بروبديسيوم علامات على حدود جدار الخلية.وتتوافق الخطوط مع نمط التعريب للـ endodermis، و pericycle xylem-pole. في هذه القياسات التمثيلية التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي المتعدد، أظهرت معظم العينات تدهورًا ضئيلًا جدًا، حيث تراوحت أعداد تكامل الحمض النووي الريبي بين تسعة إلى 10. في هذه الرسوم البيانية، يمكن ملاحظة آثار المكتبات المعدة بنجاح، مع تسليط الضوء على قوة الإجراء، على الرغم من حجم التفاعل المُتدرج.قبل إنتاج مجموعة بيانات الجينوم تمتد، TRAP RNA من تجربة تجريبية يمكن أن يكون التحقيق بواسطة رتبر كمي للتحقق من نجاح العلاج و / أو الظروف التجريبية، فضلا عن خصوصية الأنسجة. في هذا التحليل، أكد اختبار ثلاث جينات تستجيب لـ أوشين نجاح تحريض الهرمونات بعد ساعتين من العلاج. وأكدت الملامح الجينية الخاصة بالأنسجة التي تم استردادها من بيانات التسلسل خصوصية نوع الخلية.اتبع نصيحة الممارسة الجيدة عند التعامل مع الحمض النووي الريبي. العمل في مقاعد البدلاء العقيمة، وتنظيف المعدات الخاصة بك مع الحمض النووي الريبي إزالة الحل، وارتداء القفازات وتغييرها على الفور عندما تحصل ملوثة. تأكد من التعامل مع المواد الكيميائية والغازات السامة التي تم استخدامها أثناء الإجراء والتخلص منها بشكل مناسب، وخاصة غاز الكلور الفينول-DEPC والنيتروجين السائل.في محفظة الدراسات أوموميك، TRAP تحتل مكانة هامة، وقد استخدمت بالفعل للإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية، وخاصة في علم الأحياء التنموية، TRAP لديه إمكانات ضخمة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

المغناطيسية الأرضية الميدانية (GMF) وتطور النبات: التحقيق في آثار عكسية على GMF<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; التنمية والتعبير الجيني

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

الضوء بوساطة تعديل عكسها من الميتوجين تنشيط كيناز مسار البروتين خلال تمايز الخلايا و<em&gt; القيطم</em&gt; التنمية الجنينية

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...