Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

我们要感谢苏黎世遗传多样性中心的让-克洛德·沃尔瑟在该项目的早期阶段提供重要的专家建议。Vermeer 实验室的工作得到了瑞士国家科学基金会 （SNSF） 授予 JEMV 的 SNF 教授授予 （PP00P3_157524） 和 R'EQUIP 设备赠款 （316030_164086） 的支持。

1. 转基因克隆、转基因生产线生产和选择
<ol><li>在适当的入口矢量中克隆所选择的启动子。使用基于重组的克隆方法（材料表），并使用pDONRP1-P249中基于重组的克隆重新组合pDONRP4-P1r.克隆RPL18（具有亲和力标记或荧光蛋白）。</li>
	<li>使用 FAST-RED 选择盒50将包含RPL18的入口矢量与包含启动子的入口矢量在两个片段重组反应中合并到适当的目标...

验证 RPL18 本地化模式 避免任何 TRAP 实验的数据被误解的关键，是标记的核糖体子单位的正确表达模式。因此，将 GFP 作为表位标记与 RPL18 的上部标签非常优雅地允许验证所需的表达模式，并连续从同一组织中下拉多体分数。更多侵入性的方法，以确保适当的促进者模式遵循焦和梅耶罗维茨2010年，这需要GUS染色和在Tian等人2019年依靠免疫染色与抗FLAG抗体58，59。<sup...

在下一代测序技术日益应用的推动下，空间分辨率在发育生物学中可以增强。当代研究旨在解剖组织到专门的细胞类型，如果不是单细胞水平11，2，3，4。2,3,4为此，在过去五十年中，已设计了大量不同的方法（见图1A）5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。,14,,7,8,9,10,11,12,135,6 Figure 1A15
植物科学中的许多工具都是对动物研究首创的技术的适应。我们在此处详细介绍的方法不是这样。2005年，凭借蛋白质翻译的强势背景，贝利-塞雷斯实验室开始设计核糖蛋白，用于后续的亲和力纯化16。因此，它们可以避免耗时和劳动密集型的多体分析，这是基于超中心与蔗糖梯度，并用于评估翻译核糖体自20世纪60年代17，18。17,该方法自即被称为转化核糖体亲和纯化（TRAP）16。在成功的植物翻译研究后，Heiman19等人将其应用扩展到酵母20、果蝇21、异种鱼23、24。,2422
虽然模型系统的遗传改造是TRAP的先决条件，它将其应用限制在适应遗传转化的物种，人们可以同时利用这种异议，以针对特别感兴趣的细胞子集，否则极难从完整的组织/器官25（例如，在小鼠大脑中高度分支的树突状细胞或受感染的植物组织中的真菌催眠）。在植物中，所有细胞都通过细胞壁固定到位，形成静水骨架26的基础。为了将植物细胞从这个基质中释放出来，科学家要么通过激光捕获微切（LCM）27从周围组织中物理地切27出细胞，要么对细胞壁进行酶消化28。在后一个细胞中，所谓的正代，感兴趣的种群被荧光标记，可以通过荧光激活细胞分拣（FACS）7分离。7LCM通常需要将样品固定并嵌入蜡中，这最终会降低其RNA29的质量。基于FACS的方法产生高质量的RNA，但提供过程本身引入了基因表达的差异30和具有修饰和厚的继生细胞壁组织是出了名的难以治疗。此外，植物中的许多发育过程被认为是依靠机械传输的信号，因此细胞壁的完整性是最重要的31。两种方法，使用快捷方式，通过在核水平上操作来规避细胞分离，是荧光激活核分拣（FANS）和特定细胞类型（INTACT）标记的核分离。与TRAP一样，它们使用细胞类型特定的促进器来标记核，然后通过排序或拉下获得丰富，分别为,8，15。所有这些方法的一个主要挑战是从组织中的细胞子集获得足够的RNA材料。由于 TRAP 只捕获蜂窝 RNA 的一小部分，因此样本采集是一个相当大的瓶颈。因此，需要特别敏感的库准备协议来生成低输入量的高质量数据。
自建立以来，TRAP 要么与 DNA 微阵列结合使用，要么随着近年来测序成本的显著下降，RNA-seq 10、32、33 。10,32,33在Sablok等人34日回顾了许多研究问题。我们相信，在未来几年中，将会有更多的报告，因为结合不同的启动子来靶向特定的细胞类型时，该技术非常通用。最终，即使以可诱导的方式完成，也可以结合探测植物对许多生物和非生物应激因素的反应。此外，在没有稳定的转基因线的情况下，毛茸茸根表达系统也已成功用于在番茄和药质35，36,36中执行TRAP。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> 图1：翻译核糖体亲和力纯化（TRAP）补充了"经济学"分析组合。A.通过大量方法或组合，可以提高分析精度，甚至单细胞甚至亚细胞分辨率。该计划概述了目前在植物和动物领域可用的工具。细胞分辨率下的组织收集可以通过LCM或FACS等协议实现，然后与标准转录组或多体分析/翻译分析耦合。TRAP 和 INTACT 将组织捕获和 RNA 分离结合在一起，因为它们基于表上标记。然而，INTACT只样本细胞核，因此，构成转录分析的特殊情况。一个小兔子图标标记了动物领域新开发的方法：虽然SLAM-ITseq和Flura-seq依赖于在表达放任性酶的细胞中具有改性尿素碱的新生RNA的代谢靶向，Slide-seq使用带有DNA条形码的涂层玻璃幻灯片，在细胞范围内提供位置信息。APEX-seq 中遵循接近标记方法，在特定亚细胞隔间中对 RNA 进行采样。值得注意的是，分辨率提高通常需要生成转基因材料（星号），因此这些方法主要用于模型物种。TRAP 特别适用于涉及细胞壁 （CW） 或机械信号的植物科学研究，以及难以从其 CW 基质中释放的细胞物种。B. TRAP程序的详细湿实验室步骤：在不同细胞类型（如根内皮）中表达GFP标记核糖蛋白的幼苗在培养皿上生长7天，通过卡扣冷冻收获根料。在通过离心对碎片进行颗粒化之前，从均质原油提取物中采集总RNA控制样本。磁性抗GFP珠被添加到清除的提取物中，以执行免疫沉淀。孵化和三洗步骤后，通过酚-氯仿提取直接获得多体相关RNA（TRAP/多体RNA）。LCM：激光捕获微切解剖，FACS/FANS：荧光激活细胞/核分拣， APEX-seq：基于工程抗坏血剂过氧化物酶的方法，INTACT：特定细胞类型中标记的核分离，SLAM-ITseq：用于组织RNA代谢测序的THiol（SH）相关烷基化，Flura-seq：氟酸酯标记RNA测序（用Biorender.com创建）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
本文的目的是提供 TRAP 方法的详细说明，以突出显示关键步骤，并为可能的库准备方法提供指导。
通用 TRAP 实验将基本包括以下步骤（另见图1B）：（1）植物材料的准备，包括核糖体标记结构的克隆、转基因生产线的生产和选择、种子的生长和扩充、灭菌和电镀以及应力应用/处理（可选）和组织收获;（二）免疫纯化，包括组织均质化、清纯粗提取物、珠洗、免疫净化、洗涤步骤;（3） RNA提取和质量评估;（4） 图书馆准备。
阿拉伯植物根自引进示范植物37、38,38以来，一直是研究植物发展的示范系统。在这里，TRAP的应用在植物横向根开发的背景下被展示出来。在植物中，整个根系的建立依赖于这个程序的执行，因此对生物体39的生存非常重要。在Arabidopsis中，侧根起源于位于赛莱默血管旁边的围轮组织，因此被称为木质杆围轮（XPP;参见图2C）40。40一些XPP细胞，位于根的深处，获得一个创始人细胞的身份，并在局部荷尔蒙触发下，开始通过肿胀和分裂41开始增殖。然而，由于存在刚性细胞壁基质，这一过程对周围的组织施加机械应力。特别是，覆盖内皮受影响，因为它是在横向根生长轴42，43，4443,44的方式。42事实上，新形成的原体将不得不通过覆盖的内皮细胞（图2C2）生长，而皮层和表皮细胞只是被推到一边，使原体最终出现45，46。,46我们实验室最近的工作表明，内皮病正在积极推动适应围周期的增殖。靶点阻塞内皮激素信号足以抑制甚至第一分裂在XPP细胞47。因此，围周期-内皮斯通信是阿拉伯细胞横向根系发展的一个早期检查点。然而，不知道这个相声是如何进行的。为了解开这个谜团，我们选择了TRAP-seq方法来瞄准XPP和内皮细胞。为了丰富横向根程序中的细胞，我们通过外生应用辅助辛酸（1-naph甲酸，NAA）48来模拟荷尔蒙触发，同时允许暂时解决侧根形成48的初始阶段。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

在本文中，我们给出了通过翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法和连续优化的低输入库制备从不同阿拉伯生物基系thaliana根细胞类型获取的翻译数据的实践说明。
作为起始材料，我们使用植物生产线，使用适当的促进剂，以细胞类型特定的方式表达GFP标记核糖蛋白RPL18。在免疫纯化和RNA提取之前，组织被卡扣冷冻，从而保持组织的完整性，同时允许以高时间分辨率执行时间序列研究。值得注意的是，细胞壁结构保持不变，这是替代程序的一个主要缺点，例如荧光激活细胞排序方法，依靠组织原面分离不同的细胞群。此外，无需像激光捕获微解剖技术那样组织固定，从而获得高质量的RNA。
然而，从细胞亚群的取样，仅分离多体相关RNA，严重限制了RNA的产生。因此，有必要应用足够灵敏的库制备方法，以便RNA-seq成功采集数据。
TRAP 为植物研究提供了理想的工具，因为许多开发过程都涉及与细胞壁相关和机械信号通路。利用促进剂瞄准特定细胞群，正在缩小器官和单细胞水平之间的差距，而单细胞水平又因分辨率小或成本非常高而受到影响。在这里，我们应用TRAP来研究侧根形成的细胞-细胞通信。

在质量评估方面，应探讨上述过程的几个中间步骤：植物中的表达模式验证、分离的多体层RNA的质量控制以及最终库。此外，还可以使用已知标记基因进行qRT-PCR，以确认对治疗条件的反应或微调实验条件。
GFP信号分布的共聚焦分析 为了检查内皮和XPP表达模式，我们通过共聚焦显微镜分析了pELTP：：：GFP-RPL18<...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

翻译核糖体亲和纯化（TRAP）提供了以最少的器官和组织处理来解剖发育方案的可能性。该协议从绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚组细胞中产生高质量的RNA。下游分析工具（如 qRT-PCR 或 RNA-seq）可显示组织和细胞类型特定的表达特征。

翻译核糖体亲和纯化（TRAP）以研究细胞类型特异性尺度下阿拉伯生物基塔利亚纳根发育

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

使用 TRAP，我们可以研究细胞分辨率的发展处理。我们使用细胞型特异性启动子来驱动标记的核糖体子单元，从那里我们可以分离多体RNA。该协议产生高质量的RNA，但数量非常有限，因此，需要专门用于超低输入的方法来可靠地生成高质量的RNA库。TRAP 是植物研究的理想工具，因为许多发育过程依赖于细胞壁相关和机械信号通路。我们使用 TRAP研究细胞在横向根的形成中的交流。由于获得高质量的RNA证明没有我们预期的直截了当，我们希望这个分步视频指令将提高 TRAP 的适用性，并帮助推广这种强大的技术。要对传播的同源酶线进行灭菌，将少于300微升的种子均匀地撒在12个12厘米方的培养皿上，将盘子堆放在60升干燥器上。在隔夜气体灭菌后，让气体蒸发，然后再将种子收集到50毫升的储存管中。电镀前，用0.1%的加量稀释灭菌种子，每盘获得一毫升的吸收种子混合物。要盘片种子混合物，请使用方形 Petri 盘盖创建一个层压模板支架，用于每盘种植三排种子，并放入模板支架中放置空的阿加板。将一毫升的吸收种子均匀地分配到三排盘子上。将加工过的盘子堆放在层流中，直到种子干燥。当种子粘在阿加的表面时，合上盖子，用微孔胶带封住每个盘子。对于具有感兴趣的剂的阿拉伯多皮根的外源性治疗，准备1.5至2厘米宽、10厘米长的纸巾条。将纸巾浸泡在10微摩尔NAA中，并使用钳子在每一排根上涂抹一条纸巾。然后，轻轻压出任何气泡，然后从板中清空多余的液体，然后用时间标记板。在适当的实验端点，使用钳子小心地从每个板中去除纸巾条，而不分离根部，并使用手术刀片沿着拍摄根结每排切割一次，在一次确定的笔触中。使用钳子沿每行的根部轻扫，将根收集在三个捆绑包中。将根部排空成充满液氮的50毫升管，进行冷冻。收集所有每个处理根样本后，使用管盖释放多余的液氮，以防止根部溢出。将管子放入 Doer 容器中，进行 80 摄氏度的存储。对于组织研磨和均质化，请将棉手套戴在标准实验室手套下，并将 PMSF 添加到多体萃取缓冲液中。将组织样本清空为含有液氮的砂浆中，并使用冷却的害虫仔细研磨组织，直到所有材料都显示为白色粉末。当所有组织都磨碎时，在样品中加入五毫升多体提取缓冲液，并在缓冲液冻结前快速将冷冻组织片段与粉末混合。混合物一旦被转移，将泥浆倒入冰上的玻璃均质器中，再使用两毫升多体萃取缓冲液冲洗砂浆和刺。手动研磨浆料，直到提取物均匀。然后，将粗根提取物倒入50毫升离心管的冰上，并处理下一个样品，如所示。对于总RNA收集，将每个粗样品的200微升等分转移到单独的清洁、预冷、标记的微离心管中。要去除细胞壁、碎屑和大型细胞器，请将样品离心，将上清液转化为新鲜、预冷的锥形管，进行第二次离心。当管子旋转时，每样品的60微升磁GSP珠子，放入1.5毫升的管中。将管子放在磁性支架上，以方便上一杯的去除。然后，每次洗涤时，在一毫升冷洗缓冲液中清洗珠子两次，并在每个样品的60微升洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。离心后立即将清除的上清液放入标有 15 毫升的管中，并在每个样品中加入 60 微升洗珠。然后，将所有样品水平放入冰桶中，进行两个小时的摇摆孵育。在孵育结束时，收集冰上磁性支架上的珠子，并将PMSF添加到剩余的多体萃取缓冲液中。丢弃超钠后，向样品中加入约五毫升多体萃取缓冲液，然后轻轻倾斜，将样品中的珠子重新悬浮。将样品在冰上摇床上摇动 15 分钟，然后用磁铁上的新鲜洗涤缓冲液洗两次，如证明。最后一次洗涤后，将样品在一毫升的洗涤缓冲液中转移到1.5毫升的管中。并在磁性支架上收集珠子一次，去除所有上经。然后，将管子放在冰上，直到所有样品都处理完成。为了修复实验室用品，首先，将所有设备冲洗成化学废物。在彻底冲洗每个仪器之前，用肥皂洗手砂浆、刺和均质器。接下来，将设备放在一个热安全容器中，并在220摄氏度以上过夜烘烤材料。用洗涤剂清洁所有离心管，然后将管放在带边缘和烟罩的可 <3>起托盘上。将一毫升液体二乙基热碳酸盐和一升去硫水溶液倒入管中3至18小时。然后，在消毒器中的管盘消毒之前，先收集溶液。在这里，显示了具有 GFP 信号的代表性植物。用碘化丙二基反染色标记细胞壁轮廓。这些线对应于内皮的定位模式和木球杆环环。在从多体RNA获得的这些代表性测量中，大多数样本的降解程度非常小，RNA完整性值从9到10不等。在这些图形中，可以观察到成功准备的库的痕迹，尽管反应量缩小，但该过程仍突出了该程序的鲁棒性。在生成基因组跨越数据集之前，通过定量RTPCR可以探测试验实验中的 TRAP RNA，以验证治疗成功和/或实验条件，以及组织特异性。在这项分析中，对三个对奥辛反应基因的测试证实了经过两个小时的治疗后激素诱导的成功。从测序数据中检索到的组织特异性标记基因图谱证实了细胞型特异性。处理RNA时遵循良好的实践建议。在无菌工作台工作，使用 RNA 去除溶液清洁设备，戴上手套，并在受到污染后立即更换。一定要妥善处理和丢弃所有在手术过程中使用的有毒化学品和气体，特别是苯酚-DEPC氯气和液氮。在奥米研究组合中，TRAP占据着重要的一席之地，并且已经被用来回答许多生物学问题，特别是在发育生物学中，TRAP具有巨大的潜力。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

地磁场（GMF）和植物进化：调查逆转基因食品对影响<em&gt;拟南芥</em&gt;开发与基因表达

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

科研

发育生物学

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;在体内</em&gt;细胞迁移使用细胞移植和时间推移成像在斑马鱼胚胎

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

从人多能干细胞使用高度可重复的小分子为基础的分化协议心肌细胞规模化生产

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

重新编程的小鼠胚胎成纤维细胞转录因子诱导Hemogenic计划

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

建立有限元模型，研究斑马鱼下颌生物力学

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

长期共焦成像根和下胚轴发育的简单室

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径<em&gt;爪蟾</em&gt;胚胎发育

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

体外在拟南芥中受精卵分化和胚模式的活体细胞成像的胚珠培养

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

斑马鱼幼虫动物模型的建立研究锥虫运动性体内

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

小鼠胚胎心肌内祖群的定量全贴免疫荧光分析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...