Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Vi vil gerne takke Jean-Claude Walser fra Det Genetiske Mangfoldighedscenter Zürich for afgørende ekspertrådgivning i den tidlige fase af dette projekt. Arbejdet i Vermeer-laboratoriet blev støttet af et SNF Professorship grant (PP00P3_157524) og et Tilskud til R'EQUIP-udstyr (316030_164086) fra Swiss National Science Foundation (SNSF), der blev tildelt JEMV.

1. Kloning af transgene, transgene linjeproduktion og -udvælgelse
<ol><li>Klon den foretrukne promotor i den relevante indgangsvektor. Brug en rekombinationsbaseret kloningsmetode (Materialetabel) og kombiner initiativtagerne i pDONRP4-P1r. Klon RPL18 (med affinitetsmærke eller fluorescerende protein efter eget valg) ved hjælp af rekombinationsbaseret kloning i pDONRP1-P249.</li>
	<li>Komponeringsvektoren, der indeholder RPL18, med den promotorholdige indgangsvektor ...

Verificering af lokaliseringsmønsteret RPL18 Afgørende for at undgå fejlfortolkning af data fra ethvert TRAP-eksperiment er det korrekte udtryksmønster for den mærkede ribosomal-underenhed. Derfor indarbejdes GFP som en epitop tag til RPL18 meget elegant tillader verifikation af det ønskede udtryk mønster og fortløbende, pulldown af polysom fraktion fra samme væv. Mere invasive tilgange til at sikre ordentlig promotor mønstre efterfølges af Jiao og Mayerowitz 2010, som kræver GUS-farvning ...

Drevet af den stigende anvendelse af næste generations sekventeringsteknikker kan rumlig opløsning i udviklingsbiologi øges. Moderne undersøgelser har til formål at dissekere væv ned til specialiserede celletyper, hvis ikke enkeltcelleniveau1,2,3,4. Med henblik herpå er der i løbet af de sidste 50 år udviklet en overflod af forskellige metoder (se figur 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mange værktøjer i plantevidenskab har været tilpasninger af teknikker, der var banebrydende inden for dyreforsøg. Det er ikke tilfældet for den metode, vi indfører i detaljer her. I 2005, udstyret med en stærk baggrund i protein oversættelse, Bailey-Serres Lab satte sig for at ingeniør ribosomale proteiner til efterfølgende affinitet rensning16. Således kunne de undgå tidskrævende og arbejdskrævende polysome profilering, som er baseret på ultracentrifugering med en saccharose gradient og blev brugt til at vurdere oversætte ribosomer siden 1960'erne17,18. Metoden er siden blevet omtalt som translationel ribosom affinitetrensning (TRAP)16. Efter vellykkede oversættelsesundersøgelser i planter, Heiman et al. tilpasset TRAP for dyr19 og andre udvidet sin ansøgning til gær20, Drosophila21, Xenopus22 og zebrafisk23,24.
Selv om genetisk modifikation af modelsystemet er en forudsætning for TRAP, som begrænser dets anvendelse til arter, der kan underkastes genetisk transformation, kan man samtidig udnytte denne indvending til at målrette delmængder af celler, der er af særlig interesse og ellers yderst vanskeligt at isolere fra det intakte væv/organ25 (f.eks. stærkt forgrenede dendritiske celler i en musehjerne eller svampehyphae i inficeret plantevæv). I planter holdes alle celler på plads via cellevægge, der danner grundlag for det hydrostatiske skelet26. For at frigøre en plantecelle fra denne matrix har forskerne enten fysisk skåret cellen ud af det omgivende væv gennem lasercapture microdissection (LCM)27 eller udført enzymatisk fordøjelse af cellevæggene28. Blandt de sidstnævnte celler, såkaldte protoplasts, er populationen af interesse fluorescerende mærket og kan adskilles via fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)7. LCM kræver normalt en prøve, der skal fastsættes og indlejres i voks, hvilket i sidste ende forringer kvaliteten af sin RNA29. FACS-baserede metoder giver høj kvalitet RNA, men processen med protoplasting selv introducerer forskelle i genekspression30 og væv med modificerede og tykke sekundære cellevægge er notorisk vanskelige at behandle. Desuden antages mange udviklingsprocesser i planter at være afhængige af mekanisk transmitterede signaler, og derfor er cellevæggens integritet af afgørende betydning31. To metoder, der bruger en genvej til at omgå celleisolation ved at operere på niveauet af kerner, er fluorescensaktiveret nuklear sortering (FANS) og isolering af kerner mærket i bestemte celletyper (INTAKT). Som i TRAP, de bruger celletype-specifikke initiativtagere til at markere kerner, der efterfølgende bliver beriget via sortering eller trække ned, henholdsvis8,15. En stor udfordring for alle disse tilgange er at få tilstrækkeligt RNA-materiale fra delmængder af celler i et væv. Da TRAP kun fanger en brøkdel af de cellulære RNA'er, er prøveindsamling en betydelig flaskehals. Derfor er der behov for særligt følsomme biblioteksforberedelsesprotokoller for at producere data af høj kvalitet fra lave inputmængder.
Siden oprettelsen er TRAP enten blevet anvendt i kombination med DNA-mikroarrays eller, da sekventeringsomkostningerne er faldet betydeligt i de senere år, RNA-seq10,32,33. En lang række forskningsspørgsmål er allerede blevet belyst som gennemgået i Sablok et al.34. Vi er overbeviste om, at flere rapporter vil følge i de kommende år, da teknikken er meget alsidig, når man kombinerer forskellige initiativtagere til at målrette specifikke celletyper. Til sidst, Dette vil ske selv i en ukuelig måde, og kan kombineres med sondering plantens reaktion på mange biotiske og abiotiske stressfaktorer. Derudover, hvor stabile transgene linjer ikke er tilgængelige, behårede rod udtryksystemer er også blevet anvendt med succes til at udføre TRAP i tomat og medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figur 1: Oversættelse af ribosom affinitetsrensning (TRAP) supplerer analyseporteføljen "omics". A. Stigende niveauer af analytisk præcision, ned til encellede eller endda subcellulære opløsning kan opnås ved et væld af metoder eller kombinationer heraf. Ordningen giver et overblik over de værktøjer, der i øjeblikket er til rådighed på plante- og dyreområdet. Vævssamling ved cellulær opløsning kan opnås ved protokoller som LCM eller FACS, som derefter kobles til standard transkription eller polysome profileing/translatome analyse. TRAP og INTAKT integrerer både vævsindfangning og RNA-isolation, da de er baseret på epitop-tagging. Intakt e-prøver imidlertid kun cellekerner og udgør derfor et særligt tilfælde af transskriptionsanalyse. En lille kanin ikon markerer nyudviklede metoder på dyreområdet: Mens SLAM-ITseq og Flura-seq stole på metaboliske målretning af spirende RNAs med modificerede uracil baser i celler, der udtrykker eftergivende enzym, Slide-seq gør brug af en belagt glas dias med DNA stregkoder, der giver positionelle oplysninger i cellulære område. Der anvendes en nærhedsmærkningsmetode i APEX-seq for at udtage prøver af RNA'er i specifikke subcellulære rum. Navnlig kræver øget opløsning ofte generering af transgent materiale (stjerner), og disse metoder anvendes således overvejende til modelarter. TRAP er specielt velegnet til plantevidenskabelige undersøgelser, der involverer cellevæg (CW) eller mekaniker signalering samt cellearter, der er vanskelige at frigive fra deres CW matrix. B. Detaljerede vådlaboratorietrin i TRAP-proceduren: Kimplanter, der udtrykker GFP-mærket ribosomprotein i forskellige celletyper (f.eks. rodendodermis), dyrkes på petriskåle i syv dage og rodmateriale høstet ved snapfrysning. En total RNA-kontrolprøve indsamles fra det homogeniserede rå ekstrakt, før det pelleteres i snavset via centrifugering. Magnetiske anti-GFP perler tilsættes til det klare ekstrakt for at udføre immunudfældning. Efter inkubation og tre vasketrin opnås det polysomeassocierede RNA (TRAP/polysome RNA) direkte via fenol-chloroform ekstraktion. LCM: mikrodissektion af laserfanger, FACS/FANS: fluorescensaktiveret celle/nuklear sortering APEX-seq: metode baseret på manipuleret ascorbatperoxidase, INTAKT: isolering af kerner mærket i specifikke celletyper, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alkylering for metabolisk sekventering af RNA i væv, Flura-seq: fluorouracil-mærket RNA sekventering (Oprettet med Biorender.com) Klik her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">at se en større version af denne figur.</a>
Målet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af TRAP-metoden, at fremhæve kritiske trin og at give vejledning til en mulig metode til forberedelse af biblioteket.
Et generisk TRAP-eksperiment vil hovedsagelig bestå af følgende trin (se også figur 1B):(1) Fremstilling af plantemateriale, herunder kloning af ribosomt-taggingkonstruktion, transgene linjeproduktion og -udvælgelse, dyrkning og opsamling af frø, sterilisering og plettering samt stressanvendelse/-behandling (valgfri) og vævshøst; 2) immunrensning, herunder vævshomogenisering og rydning af råekstrakt, perlevask og immunrensning samt vasketrin 3) RNA-ekstraktion og kvalitetsvurdering og (4) biblioteksforberedelse.
Arabidopsis-roden har været et modelsystem til undersøgelse af planteudvikling lige siden dens indførelse som modelanlæg37,38. Her er anvendelsen af TRAP fremvist i forbindelse med anlæggetlateral rod udvikling. I planter, opbygningen af hele rodsystemet er afhængig af udførelsen af dette program og er derfor meget vigtigt for overlevelsen af organismen39. I Arabidopsisstammer laterale rødder fra pericyclevæv , der ligger ved siden af xylem-karog derfor kaldes xylempolpericycle (XPP; se figur 2C)40. Nogle XPP-celler, som er placeret dybt inde i roden, erhverve en grundlægger celleidentitet og, på en lokal hormonelle udløse, begynder at formere sig ved hævelse og dividere anticlinally41. Men på grund af tilstedeværelsen af en stiv cellevæg matrix, denne proces udøver mekanisk stress på det omgivende væv. Især er den overliggende endodermis påvirket, da det er i vejen for den laterale rodvækst akse42,43,44. Faktisk vil den nydannende primordium nødt til at vokse gennem den overliggende endodermis celle (Figur 2C2), mens cortex og epidermis celler er bare skubbet til side for primordium til endelig at dukke45,46. Nylige arbejde i vores laboratorium har vist, at endodermis aktivt bidrager til at imødekomme spredning i perihjulet. Målrettet blokering af endodermal hormonel signalering er tilstrækkelig til at hæmme selv den allerførste division i XPP-cellerne47. Derfor pericycle-endodermis kommunikation udgør en meget tidlig checkpoint for lateral rod udvikling i Arabidopsis. Det vides dog ikke, hvordan denne krydstale udføres. For at opklare dette mysterium valgte vi TRAP-seq-tilgangen til at målrette XPP og endodermale celler. At berige for celler i den laterale rod program, vi efterlignede hormonelle udløse ved eksogent anvende en auxin analog (1-naphthaleneeddikesyre, NAA)48, som samtidig lov til at tidsmæssigt løse den indledende fase af lateral roddannelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

I denne artikel giver vi praktiske instruktioner for at få oversætte data fra forskellige Arabidopsis thaliana rodcelletyper via den oversættende ribosom affinitetrensning (TRAP) metode og fortløbende optimeret lav-input bibliotek forberedelse.
Som udgangsmateriale anvender vi anlægslinjer, der udtrykker GFP-mærket ribosomprotein RPL18 på en celletypespecifik måde ved hjælp af passende promotorer. Før immunrensning og RNA-ekstraktion er vævet snapfrosset, hvilket bevarer vævsintegriteten og samtidig tillader udførelse af tidsseriestudier med høj tidsmæssig opløsning. Især, cellevæg strukturer forbliver intakt, hvilket er en stor ulempe i alternative procedurer såsom fluorescens-aktiveret celle sortering-baserede tilgange, der er afhængige af væv protoplasting at isolere forskellige cellepopulationer. Derudover er ingen vævsfiksering nødvendig som i lasercapture mikrodissektionsbaserede teknikker, som gør det muligt at opnå RNA af høj kvalitet.
Men prøveudtagning fra delpopulationer af celler og kun isolere polysome-associerede RNA alvorligt begrænser RNA udbytter. Det er derfor nødvendigt at anvende tilstrækkeligt følsomme metoder til tilberedning af biblioteker til en vellykket dataindsamling foretaget af RNA-seq.
TRAP er et ideelt værktøj til planteforskning, da mange udviklingsprocesser involverer cellevægrelaterede og mekaniske signalveje. Brugen af initiativtagere til at målrette specifikke cellepopulationer er at bygge bro over kløften mellem organ og encelleniveau, som igen lider under ringe opløsning eller meget høje omkostninger. Her anvender vi TRAP til at studere cellecellekommunikation i lateral roddannelse.

Med henblik på kvalitetsvurdering bør ovennævnte procedure undersøges på flere mellemliggende trin: validering af ekspressionsmønster i planta, kvalitetskontrol af det isolerede polysomale RNA samt af de endelige biblioteker. qRT-PCR ved hjælp af kendte markørgener kan desuden udføres for at bekræfte responsen på behandlingstilstanden eller for at finjustere forsøgsbetingelserne.
Konfokal analyse af fordeling...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Oversættelse ribosom affinitet rensning (TRAP) giver mulighed for at dissekere udviklingsprogrammer med minimal behandling af organer og væv. Protokollen giver høj kvalitet RNA fra celler målrettet med en grøn fluorescerende protein (GFP)-mærket ribosomal subunit. Downstream analyseværktøjer, såsom qRT-PCR eller RNA-seq, afslører væv og celle type-specifikke udtryk profiler.

Oversættelse ribosom affinitet Rensning (TRAP) til at undersøge Arabidopsis thaliana Root Development på en celletype-specifik skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Med TRAP kan vi undersøge udviklingsbehandling ved cellulær opløsning. Vi bruger celle-type-specifikke initiativtagere til at køre en mærket ribosomal sub-enhed, og derfra kan vi isolere polysom RNA. Denne protokol giver høj kvalitet RNA, men i meget begrænsede mængder, derfor, metoder, der er specialiseret til ultra-lav input er nødvendige for pålideligt at producere høj kvalitet RNA biblioteker.TRAP er et ideelt værktøj til planteforskning, fordi mange udviklingsprocesser er afhængige af cellevægrelaterede og mekaniske signalveje. Vi bruger TRAP til at studere celle-celle kommunikation i lateral roddannelse. Da opnåelse af god kvalitet RNA viste sig ikke så ligetil som vi forventede, håber vi, at denne trin-for-trin video instruktion vil øge TRAP anvendelighed og bidrage til at fremme denne kraftfulde teknik.At sterilisere de formerede homozygot linjer, spredes mindre end 300 mikroliter af frø jævnt på 12 med 12 centimeter kvadrerede petriskåle, og stak retterne på en 60 liter ekssiccator. Efter natten gas sterilisation, lad gassen fordampe før indsamling af frøene i en 50 milliliter opbevaringsrør. Før plating, fortyndes de steriliserede frø med 0,1% agar for at opnå en milliliter imbibed frø mix per plade.Til plade frøblandingen skal du bruge firkantede petriskålslåg til at oprette en lamineret skabelonholder til plantning af tre rækker frø pr. plade og placere tomme agarplader i skabelonholderen. Fordel en milliliter af de imbibed frø jævnt på tre rækker af plader. Og læg de forarbejdede plader i stakke i en laminar flow, indtil frøene er tørre.Når frøene har holdt sig til agarens overflade, skal du lukke lågene og forsegle hver plade med mikroportape. For eksogen behandling af Arabidopsis rødder med en agent af interesse, forberede 1,5 til to centimeter bred, 10 centimeter lang, strimler af silkepapir. Læg silkepapiret i blød i 10 mikromolar NAA, og brug pincet til at påføre en strimmel silkepapir på hver række rødder.Tryk derefter forsigtigt eventuelle luftbobler ud, og tøm den overskydende væske fra pladen, før pladen mærkes med tiden. På det relevante eksperimentelle endepunkt skal du bruge strømperne til forsigtigt at fjerne vævspapirstrimler fra hver plade uden at løsne rødderne, og brug en kirurgisk klinge til at skære en gang pr. række langs skyderodskrydset i et enkelt bestemt slag. Brug pincet til at knalde langs rødderne af hver række, for at indsamle rødderne i tre bundter.Og tømme rødderne i en 50 milliliter rør fyldt med flydende nitrogen, for snap frysning. Når alle rodprøverne pr. behandling er indsamlet, dekanteres det overskydende flydende kvælstof ved hjælp af rørlåget for at forhindre rødderne i at spilde. Og læg røret i en doer fartøj, for en 80 grader celsius opbevaring.Til vævsslibning og homogenisering skal du bære bomuldshandsker under standard laboratoriehandsker og tilføje PMSF til polysom ekstraktionsbufferen. Tøm vævsprøven i en morter indeholdende flydende nitrogen, og brug en afkølet støder til omhyggeligt at male vævene, indtil alt materialet fremstår som et hvidt pulver. Når alt vævet er blevet malet, tilsættes fem milliliter polysom ekstraktionsbuffer til prøven, og de frosne vævsfragmenter blandes hurtigt med pulveret, før bufferen fryser.Så snart blandingen kan overføres, tømme gyllen i et glas homogenis på is, og bruge yderligere to milliliter polysom ekstraktion buffer til at skylle mørtel og støder. Gyllet, indtil ekstraktet er homogent, slibes manuelt. Hæld derefter det rå rodekstrakt i et 50 milliliter centrifugerør på is, og beting den næste prøve som påvist.For total RNA-samling overføres 200 mikroliter aliquots af hver rå prøve til individuelle rene, forkølede, mærkede mikrocentrifugerør. For at fjerne cellevægge, snavs og store organeller, centrifuge prøverne og dekantere supernatanten i friske, forkølede koniske rør til en anden centrifugering. Mens rørene drejer rundt, aliquot 60 mikroliter af magnetiske GFP perler pr prøve, i en 1,5 milliliter rør.Og placere røret på en magnetisk stativ, for at lette supernatant fjernelse. Derefter vaskes perlerne to gange i en milliliter koldvaskbuffer pr. vask, og re-suspendere perlerne i 60 mikroliter vaskebuffer pr. prøve. Umiddelbart efter centrifugering, dekantere den clearede supernatant i mærket 15 milliliter rør, og tilsæt 60 mikroliter vaskede perler til hver prøve.Derefter placeres alle prøverne vandret i en isspand i en to timers inkubation med rokkende. I slutningen af inkubationen, indsamle perlerne på en magnetisk stå på is, og tilsæt PMSF til den resterende polysom ekstraktion buffer. Efter udsmid af supernatanterne tilsættes ca. fem milliliter polysom ekstraktionsbuffer til prøverne, og perlerne i prøverne med skånsom hældning suspenderes igen.Vis prøverne i 15 minutter på shakeren på is efterfulgt af to vaske med frisk vaskebuffer på magneten, som påvist. Efter den sidste vask overføres prøverne i en milliliter vaskepude til et 1,5 milliliterrør. Og saml perlerne en gang mere på den magnetiske stativ, for at fjerne alle supernatanten.Derefter anbringes rørene på is, indtil alle prøverne er blevet behandlet. Til istandsættelse af laboratorieforsyningerne skylles alt udstyret ind i det kemiske affald. Håndvask morterer, pestler og homogenisatorer med sæbe, før du skyller hvert instrument grundigt.Dernæst placere udstyr i en varmesikker beholder, og bage materialerne natten over på mere end 220 grader celsius. Børst alle centrifugerørene rene med rengøringsmiddel, før rørene anbringes på en autoklavelig bakke med en fælg og en røghætte. Hæld en milliliter flydende diethylpyrbonat og en liter deioniseret vandopløsning på rørene i tre til 18 timer.Derefter opsaml opløsningen, før du steriliserer bakken af rør i autoklaven. Her vises repræsentative planter med GFP-signaler. Counter-farvning med propidium iodid markerer cellevæggen skitserer.Linjerne svarer til lokaliseringsmønsteret for endodermis og xylem-pole pericycle. I disse repræsentative målinger fra polysom RNA viste de fleste prøver meget lidt nedbrydning, med RNA-integritetstal fra ni til 10. I disse grafer kan der observeres spor af vellykkede biblioteker, hvilket understreger procedurens robusthed på trods af nedskalerede reaktionsmængder.Før der produceres et genomspænder, kan TRAP RNA fra et pilotforsøg undersøges ved hjælp af kvantitativ RTPCR for at validere behandlingssuccesen og/eller forsøgsbetingelserne samt vævs specificiteten. I denne analyse, test af tre auxin-responsive gener bekræftet en vellykket hormon induktion efter to timers behandling. Vævsspecifikke markørgenprofiler, der blev hentet fra sekvensdataene, bekræftede celletypens specificitet.Følg gode råd om god praksis, når du håndterer RNA. Arbejd på en steril bænk, rengør dit udstyr med RNA-fjernelsesopløsning, brug handsker og skift dem straks, når de bliver forurenet. Sørg for at håndtere og kassere alle giftige kemikalier og gasser, der er blevet anvendt under proceduren, især fenol-DEPC klorgas og flydende nitrogen.I porteføljen af omic undersøgelser, trap indtager en vigtig niche, og er allerede blevet brugt til at besvare mange biologiske spørgsmål, især i udviklingsbiologi, TRAP har et enormt potentiale.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetiske felt (Gmf) og Plant Evolution: undersøgelse af virkningerne af Gmf Tilbageførsel på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Udvikling og Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale fibroblaster med transkriptionsfaktorer at fremkalde en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Opbygning Finite Element Modeller til undersøgelse Zebrafisk Jaw Biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En simpel afdeling til langvarig konfokal billeddannelse af rod- og hypokotyludvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lysmedieret reversibel modulering af den mitogenaktiverede proteinkinasevej under celledifferentiering og<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonudvikling

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering af larve zebrafisk som en dyr Model til at undersøge Trypanosoma cruzi motilitet In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...