Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

We willen Jean-Claude Walser van het Genetic Diversity Center Zürich bedanken voor cruciaal deskundig advies in de beginfase van dit project. Het werk in het Vermeer-lab werd ondersteund door een SNF Professorship grant (PP00P3_157524) en een R'EQUIP equipment grant (316030_164086) van de Swiss National Science Foundation (SNSF) toegekend aan JEMV.

1. Klonen van transgene, transgene lijnproductie en selectie
<ol><li>Kloon de promotor van keuze in de juiste ingangsvector. Gebruik een op recombinatie gebaseerde kloonmethode (Table of Materials)en combineer de promotors in pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (met affiniteitstag of fluorescerend eiwit naar keuze) met behulp van recombinatie-gebaseerd klonen in pDONRP1-P249.</li>
	<li>Combineer de instapvector die RPL18 bevat met de promotorbevattende ingangsvector in een tweefra...

Verificatie van rpl18-lokalisatiepatroon Cruciaal om verkeerde interpretatie van gegevens uit een TRAP-experiment te voorkomen, is het juiste expressiepatroon van de gelabelde ribosomale subeenheid. Daarom maakt de integratie van GFP als epitoop tag aan RPL18 zeer elegant verificatie van het gewenste expressiepatroon en achtereenvolgens, pulldown van de polysome fractie uit hetzelfde weefsel. Meer invasieve benaderingen om de juiste promotorpatronen te verzekeren worden gevolgd door Jiao en Mayerowitz...

Gedreven door de toenemende toepassing van next-generation sequencing technieken, ruimtelijke resolutie in de ontwikkelingsbiologie zou kunnen worden uitgebreid. Hedendaagse studies zijn gericht op het ontleden van weefsels tot gespecialiseerde celtypes, zo niet eencellige niveau1,2,3,4. Daartoe is in de afgelopen vijftig jaar een overvloed aan verschillende methoden bedacht (zie figuur 1A)5,6,7,8,9,11,11,12,13,14,15.
Veel instrumenten in de plantenwetenschap zijn aanpassingen van technieken die werden pionier in dierlijk onderzoek. Dit is niet het geval voor de methode die we hier in detail introduceren. In 2005, uitgerust met een sterke achtergrond in eiwitvertaling, ging het Bailey-Serres Lab op zoek naar ribosomale eiwitten voor latere affiniteitszuivering16. Zo konden ze tijdrovende en arbeidsintensieve polysome profilering vermijden, die is gebaseerd op ultracentrifugatie met een sacharosegradiënt en werd gebruikt om het vertalen van ribosomen te beoordelen sinds de jaren 196017,18. De methode is sindsdien aangeduid als translationele ribosoom affiniteit zuivering (TRAP)16. Na succesvolle translationoomstudies in planten, hebben Heiman et al. TRAP voor dieren19 en anderen de toepassing ervan uitgebreid tot gist20, Drosophila21, Xenopus22 en zebrafish23,24.
Hoewel genetische modificatie van het modelsysteem een voorwaarde is voor TRAP, dat de toepassing ervan beperkt tot soorten die vatbaar zijn voor genetische transformatie, kan men dit bezwaar tegelijkertijd benutten om subgroepen van cellen aan te pakken die van bijzonder belang zijn en anderszins uiterst moeilijk te isoleren van het intacte weefsel/orgaan25 (bijvoorbeeld sterk vertakte dendritische cellen in een muishersenof schimmelhyphae in besmet plantaardig weefsel). In planten worden alle cellen op hun plaats gehouden via celwanden die de basis vormen van het hydrostatische skelet26. Om een plantencel uit deze matrix te bevrijden, hebben wetenschappers de cel fysiek uit zijn omringende weefsel gesneden door middel van lasercapture microdissectie (LCM)27 of enzymatische spijsvertering van de celwandenuitgevoerd 28. Onder de laatste cellen, de zogenaamde protoplasten, is de populatie van belang fluorescerend gelabeld en kan worden gescheiden via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)7. LCM vereist meestal een monster te worden vastgesteld en ingebed in was, die uiteindelijk verslechtert de kwaliteit van haar RNA29. FACS-gebaseerde methoden leveren rna van hoge kwaliteit op, maar het proces van protoplasting zelf introduceert verschillen in genexpressie30 en weefsels met gemodificeerde en dikke secundaire celwanden zijn notoir moeilijk te behandelen. Bovendien wordt aangenomen dat veel ontwikkelingsprocessen in installaties afhankelijk zijn van mechanisch overgebrachte signalen en daarom is de integriteit van de celwand van het grootste belang31. Twee methoden, die een snelkoppeling gebruiken om celisolatie te omzeilen door te werken op het niveau van nucleii, zijn fluorescentie-geactiveerde nucleaire sortering (FANS) en isolatie van kernen die zijn getagd in specifieke celtypen (INTACT). Net als in TRAP gebruiken ze celtypespecifieke promotors om kernen te markeren, die vervolgens verrijkt worden via sorteren of naar beneden trekken, respectievelijk8,15. Een grote uitdaging voor al deze benaderingen is om voldoende RNA-materiaal te krijgen uit subsets van cellen in een weefsel. Aangezien TRAP slechts een fractie van de cellulaire RNA's vangt, is monsterverzameling een aanzienlijk knelpunt. Daarom zijn er vooral gevoelige protocollen voor de voorbereiding van bibliotheken nodig om gegevens van hoge kwaliteit te produceren van lage invoerhoeveelheden.
Sinds de oprichting is TRAP ofwel gebruikt in combinatie met DNA-microarrays of, aangezien de sequencingkosten de afgelopen jaren aanzienlijk daalden, RNA-seq10,32,33. Een veelheid van onderzoeksvragen is al opgehelderd zoals beoordeeld in Sablok et al.34. We zijn ervan overtuigd dat er de komende jaren meer rapporten zullen volgen, omdat de techniek zeer veelzijdig is bij het combineren van verschillende promotors om specifieke celtypen te targeten. Uiteindelijk zal dit zelfs op een ondoordringbare manier gebeuren, en kan worden gecombineerd met het indringende van de reactie van de plant op vele biotische en abiotische stressfactoren. Bovendien, waar stabiele transgene lijnen niet beschikbaar zijn, zijn harige wortelexpressiesystemen ook met succes gebruikt om TRAP uit te voeren in tomaat en medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figuur 1: Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) vormt een aanvulling op het "omics" analyseportfolio. A. Het verhogen van de mate van analytische precisie, tot eencellige of zelfs subcellulaire resolutie kan worden bereikt door een overvloed aan methoden of combinaties daarvan. De regeling geeft een overzicht van de momenteel beschikbare gereedschappen op het gebied van planten en dieren. Weefselverzameling bij cellulaire resolutie kan worden bereikt door protocollen zoals LCM of FACS, die vervolgens worden gekoppeld aan standaard transcriptome of polysome profiling /translatome analyse. TRAP en INTACT integreren zowel weefselopname als RNA-isolatie omdat ze gebaseerd zijn op epitoop-tagging. INTACT monstert echter alleen celkernen en vormt daarom een speciaal geval van transcriptoomanalyse. Een klein konijn pictogram markeert nieuw ontwikkelde methoden in het gebied van dieren: Terwijl SLAM-ITseq en Flura-seq vertrouwen op metabole targetting van ontluikende RNAs met gemodificeerde uracil bases in cellen uitdrukken van de tolerante enzym, Slide-seq maakt gebruik van een gecoate glazen dia met DNA barcodes die positionele informatie in het cellulaire bereik. Een proximity labeling benadering wordt gevolgd in APEX-seq om RNA's te proeven in specifieke subcellulaire compartimenten. Met name een verhoogde resolutie vereist vaak de productie van transgeen materiaal (sterretjes) en deze methoden worden dus voornamelijk gebruikt voor modelsoorten. TRAP is vooral geschikt voor plantenwetenschappelijke studies waarbij celwand (CW) of mechanische signalering en celsoorten die moeilijk te bevrijden zijn uit hun CW-matrix. B. Gedetailleerde wet-lab stappen van de TRAP procedure: Zaailingen uitdrukken GFP-gelabeld ribosomal eiwit in verschillende celtypes (bijvoorbeeld wortel endodermis) worden geteeld op petrischaaltjes gedurende zeven dagen en wortelmateriaal geoogst door snap bevriezing. Een totaal RNA controlemonster wordt verzameld uit het gehomogeniseerde ruwe extract voordat pelleting het puin via centrifugeren. Magnetische anti-GFP kralen worden toegevoegd aan het gewiste extract om immunoneerslag uit te voeren. Na incubatie en drie wasstappen wordt het polysome-geassocieerde RNA (TRAP/polysome RNA) rechtstreeks verkregen via fenol-chloroform extractie. LCM: lasercapture microdissectie, FACS/FANS: fluorescentie-geactiveerde cel/nucleaire sortering, APEX-seq: methode gebaseerd op ontworpen ascorbate peroxidase, INTACT: isolatie van kernen die zijn getagd in specifieke celtypen, SLAM-ITseq: thiol(SH)-gekoppelde alkylation voor de metabole sequencing van RNA in weefsel, Flura-seq: fluorourcila-label RNA-sequencing (Gemaakt met Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Het doel van dit artikel is om een gedetailleerde beschrijving van de TRAP-methode te geven, om kritieke stappen te markeren en om richtlijnen te bieden voor een mogelijke methode voor het voorbereiden van bibliotheken.
Een generiek TRAP-experiment zal hoofdzakelijk bestaan uit de volgende stappen (zie ook figuur 1B):(1) Bereiding van plantaardig materiaal, met inbegrip van het klonen van ribosoom-tagging constructie, transgene lijnproductie en -selectie, het kweken en ophopen van zaden, sterilisatie en beplating, en stresstoepassing/behandeling (optioneel) en weefseloogsten; (2) immunozuivering, met inbegrip van weefselhomogenisatie en clearing van het ruwe extract, de wassen van de kraal en de immunozuivering, en de wasstappen; (3) RNA-extractie en kwaliteitsbeoordeling; en (4) bibliotheekvoorbereiding.
De Arabidopsis wortel is een modelsysteem om plantontwikkeling te bestuderen sinds de introductie als een model plant37,38. Hier wordt de toepassing van TRAP getoond in de context van de ontwikkeling van de wortel van planten. Bij planten is de opbouw van het gehele wortelstelsel afhankelijk van de uitvoering van dit programma en is daarom zeer belangrijk voor de overleving van het organisme39. In Arabidopsiszijn laterale wortels afkomstig van pericycleweefsel dat naast xylemvaten ligt en daarom xylempaalpericycle (XPP; zie figuur 2C)40. Sommige XPP-cellen, die zich diep in de wortel bevinden, verwerven een identiteit van de stichterscel en beginnen zich, na een lokale hormonale trigger, te vermenigvuldigen door anticlinally te zwellen en te delen41. Echter, als gevolg van de aanwezigheid van een stijve celwand matrix, dit proces oefent mechanische stress op de omliggende weefsels. Met name de bovenliggende endodermis wordt beïnvloed, omdat deze in de weg staat van de laterale wortelgroeias42,43,44. Inderdaad, de nieuw gevormde primordium zal moeten groeien door de bovenliggende endodermis cel (Figuur 2C2), terwijl cortex en opperhuid cellen zijn gewoon opzij geschoven voor de primordium om eindelijk te voorschijn45,46. Recent werk in ons lab heeft aangetoond dat de endodermis actief bijdraagt aan de proliferatie in de pericycle. Gerichte blokkering van endodermale hormonale signalering is voldoende om zelfs de allereerste divisie in de XPP-cellen47te remmen. Vandaar, pericycle-endodermis communicatie vormt een zeer vroege checkpoint voor laterale wortel ontwikkeling in Arabidopsis. Het is echter niet bekend hoe deze crosstalk wordt uitgevoerd. Om dit mysterie te ontrafelen, kozen we voor de TRAP-seq-benadering om XPP- en dodermale cellen te targeten. Om te verrijken voor cellen in het laterale wortelprogramma, bootsten we de hormonale trigger na door een auxine analoog (1-naphthaleneacetisch zuur, NAA)48exogenly toe te passen, waardoor tegelijkertijd de eerste fase van laterale wortelvorming tijdelijk kon worden opgelost.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

In dit artikel geven we hands-on instructies om translationoom gegevens te verkrijgen van verschillende Arabidopsis thaliana wortelceltypes via de vertaalribomasoom affinity purification (TRAP) methode en opeenvolgende geoptimaliseerde low-input bibliotheek voorbereiding.
Als uitgangsmateriaal maken we gebruik van plantlijnen die GFP-gelabelde ribosomal eïne RPL18 op een celtype-specifieke manier uitdrukken door gebruik te maken van adequate promotors. Voorafgaand aan immunozuivering en RNA-extractie wordt het weefsel vastgemaakt, wat de weefselintegriteit behoudt en tegelijkertijd de uitvoering van tijdreeksstudies met een hoge temporele resolutie mogelijk maakt. Met name celwandstructuren blijven intact, wat een groot nadeel is in alternatieve procedures zoals op fluorescentie geactiveerde celsorteermethoden die afhankelijk zijn van weefselprotoplasting om verschillende celpopulaties te isoleren. Bovendien is er geen weefselfixatie nodig zoals in lasercapture op microdissectie gebaseerde technieken, waardoor rna van hoge kwaliteit kan worden verkregen.
Echter, bemonstering van subpopulaties van cellen en alleen isoleren polysome-geassocieerdRNA ernstig beperkt RNA opbrengsten. Het is daarom noodzakelijk om voldoende gevoelige bibliotheekbereidingsmethoden toe te passen voor succesvolle gegevensverwerving door RNA-seq.
TRAP biedt een ideaal hulpmiddel voor plantenonderzoek, omdat veel ontwikkelingsprocessen celwandgerelateerde en mechanische signaleringstrajecten omvatten. Het gebruik van promotors om specifieke celpopulaties te richten overbrugt de kloof tussen orgaan- en eencellige niveau dat op zijn beurt te lijden heeft onder weinig resolutie of zeer hoge kosten. Hier passen we TRAP toe om celcelcommunicatie te bestuderen in laterale wortelvorming.

Voor kwaliteitsbeoordeling moet de bovengenoemde procedure worden onderzocht in verschillende tussenstappen: expressiepatroonvalidatie in planta, kwaliteitscontrole van het geïsoleerde polysomale RNA en van de uiteindelijke bibliotheken. qRT-PCR met behulp van bekende markergenen kan bovendien worden uitgevoerd om de respons op de behandelingstoestand te bevestigen of om de experimentele omstandigheden te verfijnen.
Con...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Met TRAP kunnen we ontwikkelingsverwerking onderzoeken op cellulaire resolutie. We gebruiken cel-type-specifieke promotors om een gelabelde ribosomale sub-eenheid te besturen, en van daaruit kunnen we polysome RNA isoleren. Dit protocol levert RNA van hoge kwaliteit op, maar in zeer beperkte hoeveelheden zijn daarom methoden nodig die gespecialiseerd zijn voor ultralage invoer om RNA-bibliotheken van hoge kwaliteit betrouwbaar te produceren.TRAP is een ideaal hulpmiddel voor plantenonderzoek, omdat veel ontwikkelingsprocessen afhankelijk zijn van celwandgerelateerde en mechanische signaleringstrajecten. We gebruiken TRAP om celcelcommunicatie te bestuderen in laterale wortelvorming. Aangezien het verkrijgen van goede kwaliteit RNA bleek niet zo rechttoe rechtaan als we verwacht hadden, hopen we dat deze stap-voor-stap video-instructie zal trap toepasbaarheid te verhogen en te helpen bevorderen van deze krachtige techniek.Om de gepropte homozygoot lijnen te steriliseren, verspreid minder dan 300 microliter zaden gelijkmatig op 12 bij 12 centimeter vierkante petrischaaltjes, en stapel de gerechten op een 60 liter desiccator. Laat het gas na een nachtgas sterilisatie verdampen voordat u de zaden in een opslagbuis van 50 milliliter verzamelt. Verdun voor het beplating de gesteriliseerde zaden met 0,1% agar om één milliliter ingeplomeerd zaadmengsel per plaat te verkrijgen.Om de zaadmix te ver plateeren, gebruikt u vierkante petrischaaldeksels om een gelamineerde sjabloonhouder te maken voor het planten van drie rijen zaden per plaat en leg lege agarplaten in de sjabloonhouder. Verdeel een milliliter van de ingeënte zaden gelijkmatig over drie rijen platen. En plaats de verwerkte platen in stapels in een laminaire stroom, totdat de zaden droog zijn.Wanneer zaden aan het oppervlak van de agar zijn geplakt, sluit u de deksels en sluit u elke plaat af met microporetape. Voor exogene behandeling van Arabidopsis wortels met een middel van belang, bereiden 1,5 tot twee centimeter breed, 10 centimeter lang, stroken van tissue papier. Week het tissuepapier in 10 micromolar NAA, en gebruik een pincet om een strook van weefsel papier toe te passen op elke rij van wortels.Druk vervolgens voorzichtig alle luchtbellen uit en leg de overtollige vloeistof van de plaat leeg, voordat u de plaat met de tijd labelt. Gebruik op het juiste experimentele eindpunt tangen om de papierstrips van elke plaat zorgvuldig te verwijderen zonder de wortels los te maken en gebruik een chirurgisch mes om eenmaal per rij langs de schietwortelverbinding te snijden, in een enkele bepaalde slag. Gebruik een pincet om langs de wortels van elke rij te vegen, om de wortels in drie bundels te verzamelen.En leeg de wortels in een 50 milliliter buis gevuld met vloeibare stikstof, voor snap bevriezing. Wanneer alle wortelmonsters per behandeling zijn verzameld, decanteert u de overtollige vloeibare stikstof met behulp van het buisdeksel om te voorkomen dat de wortels morsen. En plaats de buis in een doener schip, voor een 80 graden Celsius opslag.Draag voor weefselslijpen en homogenisatie katoenen handschoenen onder standaard labhandschoenen en voeg PMSF toe aan de polysome extractiebuffer. Leeg het weefselmonster in een mortel met vloeibare stikstof en gebruik een afgekoelde stamper om de weefsels zorgvuldig te malen totdat al het materiaal als een wit poeder verschijnt. Wanneer al het weefsel is gemalen, voeg vijf milliliter polysome extractie buffer aan het monster, en snel meng de bevroren weefselfragmenten met het poeder voordat de buffer bevriest.Zodra het mengsel kan worden overgedragen, leeg de drijfmest in een glazen homogenisator op ijs, en gebruik een extra twee milliliter polysome extractie buffer om de mortel en stamper spoelen. Maal de drijfmest handmatig tot het extract homogeen is. Giet vervolgens het ruwe wortelextract in een 50 milliliter centrifugebuis op ijs en verwerk het volgende monster zoals aangetoond.Voor de totale RNA-collectie moet u 200 microliter aliquots van elk ruw monster overbrengen in afzonderlijke schone, voorgekoelde, gelabelde microcentrifugebuizen. Om celwanden, puin en grote organellen te verwijderen, centrifugeren de monsters en decanteren de supernatant in verse, voorgekoelde conische buizen voor een tweede centrifugatie. Terwijl de buizen draaien, aliquot 60 microliter van magnetische GFP kralen per monster, in een 1,5 milliliter buis.En plaats de buis op een magnetische standaard, om supernatant verwijdering te vergemakkelijken. Dan, was de kralen twee keer in een milliliter van koude was buffer per wasbeurt, en opnieuw opschorten de kralen in 60 microliter wasbuffer per monster. Onmiddellijk na de centrifugatie, decanteren de gewiste supernatant in gelabelde 15 milliliter buizen, en voeg 60 microliter van gewassen kralen aan elk monster.Plaats vervolgens alle monsters horizontaal in een ijsemmer, voor een twee uur durende incubatie met schommelen. Verzamel aan het einde van de incubatie de kralen op een magnetische standaard op ijs en voeg PMSF toe aan de resterende polysomische extractiebuffer. Na het weggooien van de supernatants, voeg ongeveer vijf milliliter polysome extractie buffer aan de monsters, en opnieuw opschorten de kralen in de monsters met zachte kantelen.Rock de monsters gedurende 15 minuten op de shaker op ijs, gevolgd door twee wasbeurten met verse wasbuffer op de magneet, zoals aangetoond. Breng de monsters na de laatste wasbeurt in één milliliter wasbuffer in een buis van 1,5 milliliter. En verzamel de kralen nog een keer op de magnetische standaard, om alle supernatant te verwijderen.Plaats vervolgens de buizen op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt. Voor de reconditionering van de labbenodigdheden spoelt eerst alle apparatuur in het chemisch afval. Was de mortieren, stampers en homogenisatoren met zeep, voordat u elk instrument grondig spoelt.Plaats vervolgens de apparatuur in een warmteveilige container en bak de materialen 's nachts op meer dan 220 graden Celsius. Bestrijk alle centrifugebuizen schoon met wasmiddel, voordat u de buizen op een autoclaveable lade plaatst met een velg en een rookkap. Giet een milliliter vloeibare diethyl pyrocarbonaat en een liter gedeïoniseerd water oplossing op de buizen voor drie tot 18 uur.Verzamel vervolgens de oplossing voordat u de lade van buizen in de autoclave steriliseert. Hier worden representatieve installaties met GFP-signalen getoond. Counter-kleuring met propidium jodide markeert de celwand contouren.De lijnen komen overeen met het lokalisatiepatroon van de endodermis en de xylem-pole pericycle. In deze representatieve metingen verkregen uit polysome RNA, de meeste monsters toonde zeer weinig afbraak, met RNA integriteit nummers variërend van negen tot 10. In deze grafieken kunnen sporen van met succes voorbereide bibliotheken worden waargenomen, waarbij de robuustheid van de procedure wordt benadrukt, ondanks verkleinde reactievolumes.Voordat een genoom-spanning dataset wordt geproduceerd, trap RNA uit een pilot experiment kan worden onderzocht door kwantitatieve RTPCR om de behandeling succes en / of de experimentele omstandigheden, evenals de weefselspecificiteit te valideren. In deze analyse bevestigde het testen van drie auxineresponsieve genen een succesvolle hormooninductie na twee uur behandeling. Weefselspecifieke markergenprofielen uit de sequencing gegevens bevestigden de specificiteit van het celtype.Volg goed oefenadvies wanneer je RNA behandelt. Werk op een steriele bank, reinig uw apparatuur met RNA-verwijderende oplossing, draag handschoenen en verander ze onmiddellijk wanneer ze besmet raken. Zorg ervoor dat u alle giftige chemicaliën en gassen die tijdens de procedure zijn gebruikt, met name fenol-DEPC-chloorgas en vloeibare stikstof, adequaat te verwerken en weg te gooien.In de portefeuille van omische studies, TRAP neemt een belangrijke niche, en is al gebruikt om veel biologische vragen te beantwoorden, vooral in de ontwikkelingsbiologie, TRAP heeft een enorm potentieel.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ontwikkeling en Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...