Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Nous tenons à remercier Jean-Claude Walser du Centre de diversité génétique de Zurich pour les conseils d’experts cruciaux dans la première phase de ce projet. Les travaux du laboratoire Vermeer ont été soutenus par une subvention de la Chaire SNF (PP00P3_157524) et une subvention d’équipement R’EQUIP (316030-164086) de la Fondation nationale suisse des sciences (SNSF) décernée à JEMV.

1. Clonage de la production et de la sélection transgéniques transgéniques
<ol><li>Clonez le promoteur de choix dans le vecteur d’entrée approprié. Utilisez une méthode de clonage à base de recombinaison(Tableau des matériaux) et recombiner les promoteurs dans pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (avec étiquette d’affinité ou protéine fluorescente de choix) en utilisant le clonage à base de recombinaison dans pDONRP1-P249.</li>
	<li>Combinez le vecteur d’entrée contenant ...

Vérification du modèle de localisation RPL18 Crucial pour éviter une mauvaise interprétation des données de toute expérience TRAP est le modèle d’expression approprié du sous-unité ribosomal marqué. Par conséquent, l’incorporation de GFP comme une étiquette d’épitope à RPL18 permet très élégamment la vérification du modèle d’expression désiré et consécutivement, retirer la fraction polysome du même tissu. Des approches plus invasives pour assurer des modèles de promoteu...

Poussé par l’application croissante des techniques de séquençage de nouvelle génération, la résolution spatiale en biologie du développement pourrait être augmentée. Les études contemporaines visent à disséquer les tissus vers le bas pour les types de cellules spécialisées, si ce n’est le niveau unicellulaire1,2,3,4. À cette fin, une pléthore de différentes méthodes a été conçue au cours des cinquante dernières années (voir figure 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
De nombreux outils en science végétale ont été des adaptations de techniques qui ont été pionnières dans la recherche animale. Ce n’est pas le cas pour la méthode que nous introduisons en détail ici. En 2005, doté d’un solide fond de traduction de protéines, le Laboratoire Bailey-Serres a entrepris de concevoir des protéines ribosomales pour la purification ultérieure de l’affinité16. Ainsi, ils pourraient éviter le profilage polysome long et laborieux, qui est basé sur l’ultracentrifugation avec un gradient de saccharose et a été employé pour évaluer la traduction des ribosomes depuis les années 196017,18. La méthode a depuis été appelée purification d’affinité ribosome translationnelle (TRAP)16. Après des études réussies de traduction dans les plantes, Heiman et autres ont adapté TRAP pour les animaux19 et d’autres ont étendu son application à la levure20, Drosophila21, Xenopus22 et le poisson zèbre23,24.
Bien que la modification génétique du système modèle soit une condition préalable pour TRAP, qui limite son application aux espèces qui se prêtent à la transformation génétique, on peut simultanément exploiter cette objection pour cibler des sous-ensembles de cellules qui sont d’intérêt particulier et autrement extrêmement difficiles à isoler du tissu intact/organe25 (p. ex., les cellules dendritiques fortement ramifiées dans un cerveau de souris ou hyphes fongiques dans le tissu végétal infecté). Dans les plantes, toutes les cellules sont maintenues en place par des parois cellulaires qui forment la base du squelette hydrostatique26. Pour libérer une cellule végétale de cette matrice, les scientifiques ont soit physiquement coupé la cellule de son tissu environnant par microdissection de capture laser (LCM)27 ou effectué la digestion enzymatique des parois cellulaires28. Parmi ces dernières cellules, ce que l’on appelle les protoplastes, la population d’intérêt est étiquetée fluorescentement et peut être séparée par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)7. LCM nécessite généralement un échantillon à fixer et intégré dans la cire, ce qui finit par détériorer la qualité de son ARN29. Les méthodes à base de FACS produisent de l’ARN de haute qualité, mais le processus de protoplasting lui-même introduit des différences dans l’expressiongénique 30 et les tissus avec des parois cellulaires secondaires modifiées et épaisses sont notoirement difficiles à traiter. En outre, de nombreux processus de développement dans les plantes sont supposés s’appuyer sur des signaux mécaniquement transmis et donc l’intégrité de la paroi cellulaire est d’une importance primordiale31. Deux méthodes, qui utilisent un raccourci pour contourner l’isolement cellulaire en opérant au niveau des nucléii, sont le tri nucléaire activé par la fluorescence (FANS) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT). Comme dans TRAP, ils utilisent des promoteurs spécifiques au type de cellule pour marquer les noyaux, qui se sont ensuite enrichis par tri ou tirer vers le bas, respectivement8,15. Un défi majeur pour toutes ces approches est d’obtenir suffisamment de matériel d’ARN à partir de sous-ensembles de cellules dans un tissu. Comme TRAP ne capture qu’une fraction des ARN cellulaires, la collecte d’échantillons est un goulot d’étranglement considérable. Par conséquent, des protocoles de préparation de bibliothèque particulièrement sensibles sont nécessaires pour produire des données de haute qualité à partir de faibles quantités d’entrée.
Depuis sa création, TRAP a été utilisé en combinaison avec des microrésions d’ADN ou, comme les coûts de séquençage ont chuté de manière significative ces dernières années, RNA-seq10,32,33. Une multitude de questions de recherche a déjà été élucidée tel qu’il a été examiné dans Sablok et coll.34. Nous sommes convaincus que d’autres rapports suivront dans les années à venir, car la technique est très polyvalente lorsqu’elle combine différents promoteurs pour cibler des types de cellules spécifiques. Finalement, cela se fera même d’une manière inductible, et peut être combiné avec sonder la réaction de la plante à de nombreux facteurs de stress biotiques et abiotiques. En outre, lorsque des lignées transgéniques stables ne sont pas disponibles, les systèmes d’expression des racines poilues ont également été utilisés avec succès pour effectuer TRAP dans la tomate et medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figure 1 : La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) complète le portefeuille d’analyse « omics ». R. L’augmentation des niveaux de précision analytique, jusqu’à la résolution unicellulaire ou même subcellulaire peut être obtenue par une pléthore de méthodes ou de combinaisons de celui-ci. Le programme donne un aperçu des outils actuellement disponibles dans le domaine des plantes et des animaux. La collecte de tissus à la résolution cellulaire peut être obtenue par des protocoles comme LCM ou FACS, qui sont ensuite couplés à un transcriptome standard ou à une analyse de profilage/traduction polysome. TRAP et INTACT intègrent à la fois la capture des tissus et l’isolement de l’ARN car ils sont basés sur l’épitope-marquage. Cependant, INTACT n’échantillonne que les noyaux cellulaires et constitue, par conséquent, un cas particulier d’analyse de transcriptome. Une petite icône de lapin marque des méthodes nouvellement développées dans le domaine animal : Alors que SLAM-ITseq et Flura-seq s’appuient sur la ciblage métabolique des ARN naissants avec des bases d’uracil modifiées dans les cellules exprimant l’enzyme permissive, Slide-seq utilise une diapositive en verre enduit avec des codes-barres d’ADN qui fournissent des informations de position dans la gamme cellulaire. Une approche d’étiquetage de proximité est suivie dans APEX-seq pour échantillonner les ARN dans des compartiments subcellulaires spécifiques. Notamment, une résolution accrue nécessite souvent la production de matériaux transgéniques (astérisques) et ces méthodes sont donc principalement utilisées pour les espèces modèles. TRAP est particulièrement adapté pour les études scientifiques végétales impliquant la paroi cellulaire (CW) ou la signalisation mécanique ainsi que les espèces cellulaires qui sont difficiles à libérer de leur matrice CW. B. Les étapes détaillées de la procédure TRAP : Les semis exprimant des protéines ribosomal étiquetées GFP dans des types cellulaires distincts (p. ex. endodermis de racine) sont cultivés sur des plats Petri pendant sept jours et des racines récoltées par congélation rapide. Un échantillon total de contrôle de l’ARN est prélevé sur l’extrait brut homogénéisé avant de pelleter les débris par centrifugation. Des perles magnétiques anti-GFP sont ajoutées à l’extrait effacé pour effectuer l’immunoprécipitation. Après l’incubation et trois étapes de lavage, l’ARN polysome-associé (TRAP/ARN polysome) est directement obtenu par extraction de phénol-chloroforme. LCM : microdissection de capture laser, FACS/FANS : tri cellulaire/nucléaire activé par fluorescence, APEX-seq: méthode basée sur l’ascorbate peroxidase, INTACT: isolation des noyaux étiquetés dans des types cellulaires spécifiques, SLAM-ITseq: thiol (SH) alkylation liée à la séquence métabolique de l’ARN dans les tissus, Flura-seq: fluorouracil-étiqueté RNA séquençage (Créé avec Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la méthode TRAP, de mettre en évidence les étapes critiques et de fournir des conseils pour une méthode de préparation possible de la bibliothèque.
Une expérience TRAP générique consistera essentiellement en les étapes suivantes (voir aussi la figure 1B) : (1) Préparation du matériel végétal, y compris le clonage de la construction de ribosome-marquage, la production et la sélection transgéniques de lignées, la culture et l’encombrement des graines, la stérilisation et le placage, et l’application/traitement du stress (facultatif) et la récolte des tissus; (2) l’immunopurification, y compris l’homogénéisation des tissus et le dégagement de l’extrait brut, le lavage et l’immunopurification des perles, et les étapes de lavage; (3) Évaluation de la qualité de l’ARN; et (4) la préparation de la bibliothèque.
La racine Arabidopsis a été un système modèle pour étudier le développement des plantes depuis son introduction comme une plante modèle37,38. Ici, l’application de TRAP est présentée dans le contexte du développement latéral des racines végétales. Dans les plantes, l’accumulation de l’ensemble du système racinaire repose sur l’exécution de ce programme et est donc très importante pour la survie de l’organisme39. Dans Arabidopsis, les racines latérales proviennent de tissu péricycle qui réside à côté des vaisseaux xylèmes et est donc appelé pericycle pôle xylème (XPP; voir figure 2C)40. Certaines cellules XPP, qui sont situées profondément à l’intérieur de la racine, acquièrent une identité cellulaire fondatrice et, sur un déclencheur hormonal local, commencent à proliférer en gonfleant et en divisant anticlinally41. Cependant, en raison de la présence d’une matrice rigide de mur cellulaire, ce processus exerce le stress mécanique sur les tissus environnants. En particulier, l’endoderme overlying est affecté, car il est dans la voie de l’axe de croissance latérale des racines42,43,44. En effet, le primordium nouvellement formé devra se développer à travers la cellule endodermis overlying (figure 2C2) tandis que les cellules cortex et épiderme sont juste repoussées pour que le primordium émerge enfin45,46. Des travaux récents dans notre laboratoire ont montré que l’endoderme contribue activement à la prolifération du péricycle. Le blocage ciblé de la signalisation hormonale endodermique est suffisant pour inhiber même la toute première division dans les cellules XPP47. Par conséquent, la communication péricycle-endodermis constitue un point de contrôle très précoce pour le développement latéral des racines dans Arabidopsis. On ne sait cependant pas comment cette traque est effectuée. Pour percer ce mystère, nous avons choisi l’approche TRAP-seq pour cibler XPP et les cellules endodermiques. Pour enrichir pour les cellules dans le programme de racine latérale, nous avons imité le déclencheur hormonal en appliquant exogènement un analogue auxin (acide à laphthalèneacécéétique, NAA)48, qui en même temps a permis de résoudre temporellement la phase initiale de la formation latérale de racine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

Dans cet article, nous donnons des instructions pratiques pour obtenir des données de traduction de différents types de cellules racinaires Arabidopsis thaliana par l’intermédiaire de la méthode de purification de l’affinité ribosome de traduction (TRAP) et de la préparation continue optimisée de bibliothèque à faible entrée.
En tant que matériau de départ, nous employons des lignées végétales qui expriment la protéine ribosomalE IFFOmalE RPL18 marquée par GFP d’une manière spécifique au type cellulaire par l’utilisation de promoteurs adéquats. Avant l’immunopurification et l’extraction d’ARN, le tissu est gelé, qui préserve l’intégrité des tissus et permet simultanément l’exécution d’études de série temporelle avec une résolution temporelle élevée. Notamment, les structures de mur cellulaire restent intactes, ce qui est un inconvénient majeur dans les procédures alternatives telles que les approches à base de tri cellulaire activée par fluorescence qui reposent sur le protoplasting tissulaire pour isoler les populations cellulaires distinctes. En outre, aucune fixation tissulaire n’est nécessaire comme dans les techniques basées sur la microdissection de capture laser, ce qui permet d’obtenir de l’ARN de haute qualité.
Cependant, l’échantillonnage des sous-populations de cellules et l’arn polysome-associé qui isolent limitent sévèrement les rendements d’ARN. Il est donc nécessaire d’appliquer des méthodes de préparation de bibliothèque suffisamment sensibles pour l’acquisition réussie de données par RNA-seq.
TRAP offre un outil idéal pour la recherche sur les plantes, car de nombreux processus de développement impliquent des voies de signalisation liées aux parois cellulaires et mécaniques. L’utilisation de promoteurs pour cibler des populations cellulaires spécifiques fait le pont entre le niveau d’organe et le niveau unicellulaire qui, à son tour, souffre de peu de résolution ou de coûts très élevés. Ici, nous appliquons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale de racine.

Pour l’évaluation de la qualité, la procédure susmentionné devrait être examinée à plusieurs étapes intermédiaires : validation du modèle d’expression dans planta, contrôle de la qualité de l’ARN polysomique isolé ainsi que des bibliothèques finales. qRT-PCR utilisant des gènes marqueurs connus peuvent, en outre, être exécutés pour confirmer la réponse à l’état de traitement ou pour affiner les conditions expérimentales.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Avec TRAP, nous pouvons étudier le traitement du développement à la résolution cellulaire. Nous utilisons des promoteurs spécifiques au type de cellule pour conduire une sous-unité ribosomique marquée, et à partir de là, nous pouvons isoler l’ARN polysome. Ce protocole donne un ARN de haute qualité, mais en quantités très limitées, par conséquent, des méthodes spécialisées pour les intrants ultra-faibles sont nécessaires pour produire de manière fiable des bibliothèques d’ARN de haute qualité.TRAP est un outil idéal pour la recherche végétale, car de nombreux processus de développement reposent sur des voies de signalisation mécaniques et liées à la paroi cellulaire. Nous utilisons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale des racines. Comme l’obtention d’ARN de bonne qualité ne s’est pas avérée aussi simple que nous l’avions prévu, nous espérons que cette instruction vidéo étape par étape augmentera l’applicabilité TRAP et aidera à promouvoir cette technique puissante.Pour stériliser les lignes d’homozygotes propagées, étalez moins de 300 microlitres de graines uniformément sur 12 plats de Petri carrés de 12 centimètres, et empilez les plats sur un desiccator de 60 litres. Après la stérilisation du gaz pendant la nuit, laisser le gaz s’évaporer avant de recueillir les graines dans un tube de stockage de 50 millilitres. Avant le placage, diluer les graines stérilisées avec 0,1 % d’agar pour obtenir un millilitre de mélange de graines imbibées par assiette.Pour plaquer le mélange de graines, utilisez des couvercles carrés de boîte de Petri pour créer un support de modèle laminé pour planter trois rangées de graines par plaque, et placez les plaques vides d’agar dans le support de modèle. Répartir uniformément un millilitre des graines imbibées sur trois rangées d’assiettes. Et placez les assiettes traitées dans des piles dans un flux laminaire, jusqu’à ce que les graines soient sèches.Lorsque les graines sont collées à la surface de l’agar, fermez les couvercles et scellez chaque assiette avec du ruban micropore. Pour le traitement exogène des racines d’Arabidopsis avec un agent d’intérêt, préparez des bandes de papier de soie de 1,5 à 2 centimètres de large, de 10 centimètres de long. Faire tremper le papier de soie dans 10 micromolaires NAA, et utiliser des pinces à épiler pour appliquer une bande de papier de soie à chaque rangée de racines.Ensuite, appuyez doucement sur les bulles d’air et videz l’excès de liquide de la plaque, avant d’étiqueter la plaque avec le temps. Au point d’extrémité expérimental approprié, utilisez des forceps pour enlever soigneusement les bandes de papier de soie de chaque plaque sans détacher les racines, et utilisez une lame chirurgicale pour couper une fois par rangée le long de la jonction shoot-root, en un seul coup déterminé. Utilisez des pinces à épiler pour glisser le long des racines de chaque rangée, pour recueillir les racines en trois faisceaux.Et videz les racines dans un tube de 50 millilitres rempli d’azote liquide, pour obtenir un gel instantané. Lorsque tous les échantillons de racines par traitement ont été prélevés, décanter l’excès d’azote liquide à l’aide du couvercle du tube pour empêcher les racines de se renverser. Et placez le tube dans un récipient de faiseur, pour un stockage de 80 degrés Celsius.Pour le broyage et l’homogénéisation des tissus, portez des gants de coton sous des gants de laboratoire standard et ajoutez le PMSF au tampon d’extraction polysome. Videz l’échantillon de tissu dans un mortier contenant de l’azote liquide et utilisez un pilon refroidi pour moudre soigneusement les tissus jusqu’à ce que tout le matériau apparaisse sous forme de poudre blanche. Lorsque tout le tissu a été broyé, ajouter cinq millilitres de tampon d’extraction polysome à l’échantillon, et mélanger rapidement les fragments de tissu congelé avec la poudre avant que le tampon gèle.Dès que le mélange peut être transféré, vider le lisier dans un homogénéiseur en verre sur la glace, et utiliser deux millilitres supplémentaires de tampon d’extraction polysome pour rincer le mortier et le pilon. Moudre manuellement le lisier jusqu’à ce que l’extrait soit homogène. Ensuite, versez l’extrait de racine brute dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace, et traiter l’échantillon suivant tel que démontré.Pour la collecte totale de l’ARN, transférez 200 aliquots de microlitres de chaque échantillon brut dans des tubes de microcentrifugeuses propres, pré-refroidis et étiquetés. Pour enlever les parois cellulaires, les débris et les gros organites, centrifugez les échantillons et décantez le surnatant en tubes coniques frais et pré-refroidis pour une deuxième centrifugation. Pendant que les tubes tournent, aliquot 60 microlitres de perles magnétiques GFP par échantillon, dans un tube de 1,5 millilitre.Et placez le tube sur un support magnétique, pour faciliter l’enlèvement des supernatants. Ensuite, lavez les perles deux fois en un millilitre de tampon de lavage à froid par lavage, et suspendez les perles dans 60 microlitres de tampon de lavage par échantillon. Immédiatement après la centrifugation, décanter le supernatant défriché en tubes étiquetés de 15 millilitres et ajouter 60 microlitres de perles lavées à chaque échantillon.Ensuite, placez tous les échantillons horizontalement dans un seau à glace, pendant une incubation de deux heures avec basculement. À la fin de l’incubation, recueillir les perles sur un support magnétique sur la glace et ajouter le PMSF au tampon d’extraction du polysome restant. Après avoir jeté les supernatants, ajouter environ cinq millilitres de tampon d’extraction polysome aux échantillons, et re-suspendre les perles dans les échantillons avec inclinaison douce.Rock les échantillons pendant 15 minutes sur le shaker sur la glace, suivie de deux lavages avec tampon de lavage frais sur l’aimant, comme démontré. Après le dernier lavage, transférer les échantillons dans un millilitre de tampon de lavage, dans un tube de 1,5 millilitre. Et recueillir les perles une fois de plus sur le support magnétique, pour enlever tous les supernatants.Ensuite, placez les tubes sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités. Pour le reconditionnement des fournitures du laboratoire, d’abord, rincer tout l’équipement dans les déchets chimiques. Laver à la main les mortiers, les pilons et les homogénéisants avec du savon, avant de rincer soigneusement chaque instrument.Ensuite, placez l’équipement dans un contenant sécuritaire pour la chaleur et faites cuire les matériaux toute la nuit à plus de 220 degrés Celsius. Badigeonner tous les tubes de centrifugeuse de détergent, avant de placer les tubes sur un plateau autoclavé avec une jante et une hotte de fumée. Verser un millilitre de pyrocarbonate de diéthyle liquide et un litre de solution d’eau déionisée sur les tubes pendant trois à 18 heures.Ensuite, recueillir la solution avant de stériliser le plateau de tubes dans l’autoclave. Ici, des plantes représentatives avec des signaux GFP sont affichées. La contre-coloration avec l’iodure de propidium marque les contours de la paroi cellulaire.Les lignes correspondent au modèle de localisation de l’endoderme et au péricycle xylème-pôle. Dans ces mesures représentatives obtenues à partir de l’ARN polysome, la plupart des échantillons ont montré très peu de dégradation, avec des nombres d’intégrité d’ARN allant de neuf à dix. Dans ces graphiques, des traces de bibliothèques préparées avec succès peuvent être observées, mettant en évidence la robustesse de la procédure, malgré des volumes de réaction réduits.Avant la production d’un ensemble de données couvrant le génome, l’ARN TRAP d’une expérience pilote peut être sondé par RTPCR quantitatif pour valider le succès du traitement et/ou les conditions expérimentales, ainsi que la spécificité des tissus. Dans cette analyse, l’essai de trois gènes auxin-sensibles a confirmé une induction réussie d’hormone après deux heures de traitement. Les profils génétiques marqueurs spécifiques aux tissus récupérés à partir des données de séquençage ont confirmé la spécificité de type cellulaire.Suivez les bons conseils de pratique lorsque vous manipulez de l’ARN. Travaillez sur un banc stérile, nettoyez votre équipement avec une solution d’élimination de l’ARN, portez des gants et changez-les immédiatement lorsqu’ils sont contaminés. Assurez-vous de manipuler et de jeter de façon appropriée tous les produits chimiques et gaz toxiques qui ont été utilisés au cours de la procédure, en particulier le chlore phénol-DEPC et l’azote liquide.Dans le portefeuille des études omiques, TRAP occupe un créneau important, et a déjà été utilisé pour répondre à de nombreuses questions biologiques, en particulier en biologie du développement, TRAP a un énorme potentiel.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Champ géomagnétique (FMV) et Evolution des végétaux: Étude des effets de la GMF Reprise sur<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Développement et Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Recherche

Biologie du développement

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

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Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

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Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

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