Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Wir danken Jean-Claude Walser vom Genetic Diversity Center Zürich für die entscheidende fachkundige Beratung in der frühen Phase dieses Projekts. Die Arbeit im Vermeer-Labor wurde durch ein SNF-Professurstipendium (PP00P3_157524) und ein R'EQUIP-Ausrüstungsstipendium (316030_164086) des Schweizerischen Nationalfonds (SNF) unterstützt, das jeMV verliehen wurde.

1. Klonen von Transgen, transgenen Linienproduktion und -auswahl
<ol><li>Klonen Sie den Promotor der Wahl im entsprechenden Eintragsvektor. Verwenden Sie eine rekombinationsbasierte Klonmethode (Materialtabelle) und kombinieren Sie die Promotoren in pDONRP4-P1r. Klonen RPL18 (mit Affinitäts-Tag oder fluoreszierendem Protein der Wahl) unter Verwendung des rekombinationsbasierten Klonens in pDONRP1-P249.</li>
	<li>Kombinieren Sie den Eintragsvektor, der RPL18 enthält, m...

Überprüfung des RPL18-Lokalisierungsmusters Entscheidend, um eine Fehlinterpretation von Daten aus jedem TRAP-Experiment zu vermeiden, ist das richtige Ausdrucksmuster der markierten ribosomalen Untereinheit. Daher ermöglicht die Aufnahme von GFP als Epitop-Tag in RPL18 sehr elegant die Überprüfung des gewünschten Expressionsmusters und nacheinander den Pulldown der Polysomenfraktion aus demselben Gewebe. Invasivere Ansätze zur Sicherstellung der richtigen Promotormuster folgen jiao und Mayerow...

Angetrieben durch die zunehmende Anwendung von Sequenzierungstechniken der nächsten Generation könnte die räumliche Auflösung in der Entwicklungsbiologie erweitert werden. Zeitgenössische Studien zielen darauf ab, Gewebe bis hin zu spezialisierten Zelltypen, wenn nicht einzellig,1,2,3,4zu sezieren. Zu diesem Zweck wurde in den letzten fünfzig Jahren eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt (siehe Abbildung 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Viele Werkzeuge in der Pflanzenwissenschaft waren Anpassungen von Techniken, die in der Tierforschung Pionierarbeit geleistet haben. Dies gilt nicht für die Methode, die wir hier im Detail einführen. Im Jahr 2005, ausgestattet mit einem starken Hintergrund in der Protein-Übersetzung, machte sich das Bailey-Serres Lab daran, ribosomale Proteine für die anschließende Affinitätsreinigung zu entwickeln16. So konnten sie eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Polysomenprofilierung vermeiden, die auf einer Ultrazentrifugation mit einem Saccharosegradienten basiert und seit den 1960er Jahren17,,18zur Beurteilung der Übersetzen von Ribosomen verwendet wurde. Das Verfahren wird seitdem als translationale Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)16bezeichnet. Nach erfolgreichen translatome Studien in Pflanzen, Heiman et al. angepasst TRAP für Tiere19 und andere erweitert seine Anwendung auf Hefe20, Drosophila21, Xenopus22 und Zebrafisch23,24.
Obwohl die genetische Veränderung des Modellsystems eine Voraussetzung für TRAP ist, das seine Anwendung auf Arten beschränkt, die für die genetische Transformation geeignet sind, kann man diesen Einwand gleichzeitig gegen Zielteilmengen von Zellen nutzen, die von besonderem Interesse sind und ansonsten extrem schwierig sind, sich vom intakten Gewebe/Organ25 zu isolieren (z. B. stark verzweigte dendritische Zellen in einem Maushirn oder Pilzhyphen im infizierten Pflanzengewebe). In Pflanzen werden alle Zellen über Zellwände an Ort und Stelle gehalten, die die Grundlage des hydrostatischen Skeletts26bilden. Um eine Pflanzenzelle aus dieser Matrix zu befreien, haben Wissenschaftler die Zelle entweder durch Lasercapture Microdissection (LCM)27 physisch aus ihrem umgebenden Gewebe geschnitten oder die enzymatische Verdauung der Zellwände durchgeführt28. Unter den letztgenannten Zellen, sogenannten Protoplasten, ist die Interessenpopulation fluoreszierend gekennzeichnet und kann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)7abgetrennt werden. LCM erfordert in der Regel, dass eine Probe fixiert und in Wachs eingebettet wird, was letztlich die Qualität ihrer RNA29verschlechtert. FACS-basierte Methoden liefern hochwertige RNA, aber der Protoplasting-Prozess selbst führt zu Unterschieden in der Genexpression30 und Gewebe mit modifizierten und dicken sekundären Zellwänden sind notorisch schwer zu behandeln. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass viele Entwicklungsprozesse in Anlagen auf mechanisch übertragenen Signalen beruhen und daher die Integrität der Zellwand von größter Bedeutung ist31. Zwei Methoden, die eine Abkürzung verwenden, um die Zellisolation zu umgehen, indem sie auf der Ebene von Nukleii arbeiten, sind fluoreszenzaktivierte nukleare Sortierung (FANS) und Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen (INTACT) markiert sind. Wie in TRAP verwenden sie zelltypspezifische Promotoren, um Kerne zu markieren, die anschließend durch Sortierung angereichert oder heruntergezogen werden, bzw.8,15. Eine große Herausforderung für all diese Ansätze besteht darin, ausreichend RNA-Material aus Teilmengen von Zellen in einem Gewebe zu erhalten. Da TRAP nur einen Bruchteil der zellulären RNAs erfasst, stellt die Probensammlung einen erheblichen Engpass dar. Daher sind besonders sensible Bibliotheksvorbereitungsprotokolle erforderlich, um qualitativ hochwertige Daten aus geringen Eingabemengen zu erzeugen.
Seit seiner Gründung wurde TRAP entweder in Kombination mit DNA-Mikroarrays oder, da die Sequenzierungskosten in den letzten Jahren deutlich gesunken sind, RNA-seq10,32,33verwendet. Eine Vielzahl von Forschungsfragen wurde bereits erläutert, wie in Sablok et al.34begutachtet. Wir sind überzeugt, dass in den kommenden Jahren weitere Berichte folgen werden, da die Technik sehr vielseitig ist, wenn verschiedene Promotoren kombiniert werden, um bestimmte Zelltypen anzusprechen. Schließlich, Dies wird auch in einer induzierbaren Weise getan werden, und kann mit Sondierung der Pflanze Reaktion auf viele biotische und abiotische Stressfaktoren kombiniert werden. Darüber hinaus, wo stabile transgene Linien nicht verfügbar sind, wurden haarige Wurzelexpressionssysteme auch erfolgreich verwendet, um TRAP in Tomaten und medicago35,36durchzuführen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Abbildung 1: Übersetzen der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ergänzt das Analyseportfolio "omics". A. Eine Erhöhung der analytischen Präzision bis hin zur einzelligen oder sogar subzellulären Auflösung kann durch eine Vielzahl von Methoden oder Kombinationen davon erreicht werden. Die Regelung gibt einen Überblick über die derzeit verfügbaren Werkzeuge im Pflanzen- und Tierbereich. Die Gewebesammlung bei zellulärer Auflösung kann durch Protokolle wie LCM oder FACS erreicht werden, die dann an Standard-Transkriptom oder Polysomenprofiling/Translatom-Analyse gekoppelt werden. TRAP und INTACT integrieren sowohl die Gewebeabscheidung als auch die RNA-Isolierung, da sie auf Epitop-Tagging basieren. INTACT-Proben stellen jedoch nur Zellkerne dar und stellen daher einen besonderen Fall der Transkriptomanalyse dar. Ein kleines Kaninchensymbol markiert neu entwickelte Methoden im Tierbereich: Während SLAM-ITseq und Flura-seq auf metabolische Targetting von entstehenden RNAs mit modifizierten Uracil-Basen in Zellen setzen, die das freizügige Enzym exemittieren, verwendet Slide-seq einen beschichteten Glasschlitten mit DNA-Barcodes, die Positionsinformationen im Zellbereich liefern. In APEX-seq wird ein Näherungsetikettierungsansatz verfolgt, um RNAs in bestimmten subzellulären Kompartimenten zu testen. Insbesondere erfordert eine höhere Auflösung oft die Erzeugung von transgenem Material (Sternchen) und diese Methoden werden daher überwiegend für Modellarten verwendet. TRAP eignet sich besonders für pflanzenwissenschaftliche Studien mit Zellwand (CW) oder mechanischer Signalisierung sowie Zellarten, die schwer aus ihrer CW-Matrix freigesetzt werden können. B. Detaillierte Nasslaborschritte des TRAP-Verfahrens: Sämlinge, die GFP-markiertes ribosomales Protein in verschiedenen Zelltypen (z.B. Wurzelendodermis) exzessieren, werden sieben Tage lang auf Petrischalen angebaut und Wurzelmaterial durch Snap Freezing geerntet. Aus dem homogenisierten Rohextrakt wird eine vollständige RNA-Kontrollprobe entnommen, bevor die Trümmer mittels Zentrifugation granuliert werden. Magnetische Anti-GFP-Perlen werden dem gelöschten Extrakt hinzugefügt, um Immunpräzipitation durchzuführen. Nach Inkubation und drei Waschschritten wird die polysome-assoziierte RNA (TRAP/Polysome RNA) direkt über die Phenol-Chlor-Form-Extraktion erhalten. LCM: Lasercapture Mikrodissektion, FACS/FANS: fluoreszenzaktivierte Zell-/Kernsortierung, APEX-seq: Methode basierend auf der entwickelten Ascorbatperoxidase, INTACT: Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen getaggt sind, SLAM-ITseq: Thiol(SH)-verknüpfte Alkylierung zur metabolischen Sequenzierung von RNA im Gewebe, Flura-seq: fluorouracil-markierte RNA-Sequenzierung (Created with <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Biorender.com)</a>
Das Ziel dieses Artikels besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der TRAP-Methode bereitzustellen, kritische Schritte hervorzuheben und Anleitungen für eine mögliche Bibliotheksvorbereitungsmethode bereitzustellen.
Ein generisches TRAP-Experiment besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten (siehe auch Abbildung 1B):(1) Vorbereitung von Pflanzenmaterial einschließlich Klonen von Ribosomen-Tagging-Konstrukt, transgener Linienproduktion und -auswahl, Anbau und Füllstoffe von Saatgut, Sterilisation und Beschichtung sowie Stressanwendung/-behandlung (optional) und Gewebeernte; (2) Immunreinigung einschließlich Gewebehomogenisierung und Reinigung des Rohextrakts, Perlenwäsche und Immunreinigung sowie Waschschritte; (3) RNA-Extraktion und Qualitätsbewertung; und (4) Bibliotheksvorbereitung.
Die Arabidopsis-Wurzel ist seit ihrer Einführung als Modellpflanze ein Modellsystem zur Erforschung der Pflanzenentwicklung37,38. Hier wird die Anwendung von TRAP im Kontext der Pflanzen-Lateralwurzelentwicklung präsentiert. Bei Pflanzen beruht der Aufbau des gesamten Wurzelsystems auf der Durchführung dieses Programms und ist daher sehr wichtig für das Überleben des Organismus39. Bei Arabidopsisstammen laterale Wurzeln aus Pericycle-Gewebe, das sich neben Xylemgefäßen befindet und daher als Xylempol-Pericycle (XPP; siehe Abbildung 2C)40bezeichnet wird. Einige XPP-Zellen, die sich tief in der Wurzel befinden, erhalten eine Gründerzellidentität und beginnen sich nach einem lokalen hormonellen Auslöser durch Schwellung und Spaltung antiklinal41zu vermehren. Aufgrund des Vorhandenseins einer starren Zellwandmatrix übt dieser Prozess jedoch mechanische Belastung der umgebenden Gewebe aus. Insbesondere ist die darüber liegende Endodermis betroffen, da sie sich im Weg der seitlichen Wurzelwachstumsachse42,43,44befindet. Tatsächlich muss das sich neu formende Primordium durch die darüber liegende Endodermis-Zelle wachsen (Abbildung 2C2), während Kortex- und Epidermiszellen gerade beiseite geschoben werden, damit das Primordium schließlich45,46entsteht. Jüngste Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass die Endodermis aktiv dazu beiträgt, die Proliferation im Pericycle zu bewältigen. Gezielte Blockierung der endodermalen hormonellen Signalisierung reicht aus, um auch die erste Division in den XPP-Zellen47zu hemmen. Daher stellt die Pericycle-Endodermis-Kommunikation einen sehr frühen Checkpoint für die laterale Wurzelentwicklung in Arabidopsisdar. Es ist jedoch nicht bekannt, wie dieser Übersprechen durchgeführt wird. Um dieses Geheimnis zu lüften, haben wir den TRAP-seq-Ansatz gewählt, um XPP- und Endodermale Zellen anzuvisieren. Um uns für Zellen im lateralen Wurzelprogramm anzureichern, imitierten wir den hormonellen Auslöser, indem wir exogen ein Auxin-Analog (1-Naphthalenesessigsäure, NAA)48auftragen, das gleichzeitig erlaubte, die Anfangsphase der lateralen Wurzelbildung zeitlich aufzulösen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

In diesem Artikel geben wir praktische Anweisungen, um translatome Daten von verschiedenen Arabidopsis thaliana Wurzelzelltypen über die übersetzende Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)-Methode und die konsekutive optimierte Bibliotheksvorbereitung mit niedrigem Input zu erhalten.
Als Ausgangsmaterial verwenden wir Anlagenlinien, die gfP-markiertes ribosomales Protein RPL18 zelltypspezifisch durch den Einsatz geeigneter Promotoren ausdrücken. Vor der Immunreinigung und RNA-Extraktion wird das Gewebe schnappgefroren, was die Gewebeintegrität bewahrt und gleichzeitig die Durchführung von Zeitreihenstudien mit hoher zeitlicher Auflösung ermöglicht. Insbesondere bleiben Zellwandstrukturen intakt, was einen großen Nachteil in alternativen Verfahren wie fluoreszenzaktivierten Zellsortier-basierten Ansätzen darstellt, die auf Gewebeprotoplasting angewiesen sind, um verschiedene Zellpopulationen zu isolieren. Darüber hinaus ist keine Gewebefixierung notwendig wie bei lasercapture mikrodissektionbasierten Techniken, die es ermöglichen, hochwertige RNA zu erhalten.
Die Probenahme aus Subpopulationen von Zellen und die Isolierung der polysomenassoziierten RNA schränke die RNA-Ausbeute jedoch stark ein. Daher ist es notwendig, ausreichend empfindliche Methoden zur Bibliotheksvorbereitung für eine erfolgreiche Datenerfassung durch RNA-seq anzuwenden.
TRAP bietet ein ideales Werkzeug für die Pflanzenforschung, da viele Entwicklungsprozesse zellwandbezogene und mechanische Signalwege beinhalten. Der Einsatz von Promotoren zur Gezielten Anwendung auf bestimmte Zellpopulationen überbrückt die Kluft zwischen Organ- und Einzelzellebene, die wiederum unter geringer Auflösung oder sehr hohen Kosten leiden. Hier wenden wir TRAP zur Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation bei der lateralen Wurzelbildung an.

Zur Qualitätsbewertung sollte das oben genannte Verfahren in mehreren Zwischenschritten untersucht werden: Expressionsmustervalidierung in Planta, Qualitätskontrolle der isolierten polysomalen RNA sowie der Endbibliotheken. qRT-PCR mit bekannten Markergenen kann darüber hinaus durchgeführt werden, um die Reaktion auf den Behandlungszustand zu bestätigen oder die experimentellen Bedingungen zu optimieren.
Konfokale A...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Mit TRAP können wir die Entwicklungsverarbeitung bei zellulärer Auflösung untersuchen. Wir verwenden zelltypspezifische Promotoren, um eine markierte ribosomale Subeinheit zu fahren, und von dort aus können wir Polysomen-RNA isolieren. Dieses Protokoll liefert qualitativ hochwertige RNA, aber in sehr begrenzten Mengen sind daher Methoden erforderlich, die auf ultra-niedrige Eingaben spezialisiert sind, um zuverlässig hochwertige RNA-Bibliotheken zu produzieren.TRAP ist ein ideales Werkzeug für die Pflanzenforschung, da viele Entwicklungsprozesse auf zellwandbezogenen und mechanischen Signalwegen beruhen. Wir verwenden TRAP, um die Zell-Zell-Kommunikation bei der lateralen Wurzelbildung zu untersuchen. Da sich die Erlangung von RNA-Qualität nicht so geradlinig wie erwartet erwies, hoffen wir, dass diese Schritt-für-Schritt-Videoanleitung die TRAP-Anwendbarkeit erhöhen und dazu beitragen wird, diese leistungsstarke Technik zu fördern.Um die vermehrten homozygoten Linien zu sterilisieren, verteilen Sie weniger als 300 Mikroliter Samen gleichmäßig auf 12 mal 12 Zentimeter quadratische Petrischalen und stapeln Sie die Gerichte auf einem 60-Liter-Austrocknungsrezept. Nach der nächtlichen Gassterilisation das Gas verdampfen lassen, bevor es die Samen in ein 50-Milliliter-Speicherrohr sammelt. Verdünnen Sie vor der Beschichtung die sterilisierten Samen mit 0,1% Agar, um pro Platte einen Milliliter imprägnierter Samenmischung zu erhalten.Um die Samenmischung zu verpflanzen, verwenden Sie quadratische Petrischalendeckel, um einen laminierten Schablonenhalter für die Pflanzung von drei Reihen von Samen pro Platte zu erstellen, und legen Sie leere Agarplatten in den Schablonenhalter. Verteilen Sie einen Milliliter der imbibed Samen gleichmäßig auf drei Reihen von Tellern. Und legen Sie die verarbeiteten Platten in Stapel in einem laminaren Fluss, bis die Samen trocken sind.Wenn Die Samen an der Oberfläche des Agars kleben, schließen Sie die Deckel und versiegeln Sie jede Platte mit Mikroporenband. Für die exogene Behandlung von Arabidopsis-Wurzeln mit einem Voninteresseer Wirkstoff 1,5 bis zwei Zentimeter breit, 10 Zentimeter lang, Streifen von Tissuepapier vorbereiten. Das Tissuepapier in 10 mikromolare NAA einweichen und eine Pinzette verwenden, um einen Streifen Tissuepapier auf jede Wurzelreihe aufzutragen.Drücken Sie dann vorsichtig alle Luftblasen heraus und entleeren Sie die überschüssige Flüssigkeit von der Platte, bevor Sie die Platte mit der Zeit beschriften. Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Tissue-Papierstreifen sorgfältig von jeder Platte, ohne die Wurzeln zu lösen, und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einmal pro Reihe entlang der Triebwurzel-Kreuzung in einem einzigen bestimmten Strich zu schneiden. Verwenden Sie eine Pinzette, um entlang der Wurzeln jeder Zeile zu wischen, um die Wurzeln in drei Bündeln zu sammeln.Und leeren Sie die Wurzeln in einem 50 Milliliter Rohr mit flüssigem Stickstoff gefüllt, für Snap Freezing. Wenn alle Wurzelproben pro Behandlung gesammelt wurden, dekantieren Sie den überschüssigen flüssigen Stickstoff mit dem Rohrdeckel, um zu verhindern, dass die Wurzeln versickern. Und legen Sie die Röhre in ein Doer-Gefäß, für eine 80 Grad Celsius Lagerung.Zum Gewebeschleifen und Homogenisieren Baumwollhandschuhe unter Standard-Laborhandschuhen tragen und PMSF in den Polysomenextraktionspuffer aufnehmen. Leeren Sie die Gewebeprobe in einen Mörtel, der flüssigen Stickstoff enthält, und verwenden Sie einen gekühlten Stößel, um das Gewebe sorgfältig zu mahlen, bis das gesamte Material als weißes Pulver erscheint. Wenn das gesamte Gewebe geschliffen ist, fügen Sie der Probe fünf Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu und mischen Sie die gefrorenen Gewebefragmente schnell mit dem Pulver, bevor der Puffer gefriert.Sobald die Mischung übertragen werden kann, entleeren Sie die Gülle in einen Glashomogenisator auf Eis und verwenden Sie weitere zwei Milliliter Polysomenextraktionspuffer, um mörtel und stößezuspülen. Die Gülle manuell mahlen, bis der Extrakt homogen ist. Dann gießen Sie den Rohwurzelextrakt in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr auf Eis und verarbeiten Sie die nächste Probe wie gezeigt.Für die gesamte RNA-Sammlung 200 Mikroliter-Aliquots jeder Rohprobe in einzelne saubere, vorgekühlte, markierte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Um Zellwände, Schutt und große Organellen zu entfernen, zentrieren Sie die Proben und dekantieren Sie den Überstand in frische, vorgekühlte konische Röhren für eine zweite Zentrifugation. Während sich die Röhren drehen, werden 60 Mikroliter magnetischer GFP-Perlen pro Probe in ein 1,5-Milliliter-Rohr einfließen.Und stellen Sie das Rohr auf einen magnetischen Ständer, um die Überstandentfernung zu erleichtern. Dann waschen Sie die Perlen zweimal in einem Milliliter Kaltwaschpuffer pro Wäsche, und hängen Sie die Perlen in 60 Mikroliter Waschpuffer pro Probe wieder auf. Unmittelbar nach der Zentrifugation den gereinigten Überstand in beschriftete 15-Milliliter-Rohre dekantieren und 60 Mikroliter gewaschene Perlen zu jeder Probe hinzufügen.Legen Sie dann alle Proben horizontal in einen Eiskübel, für eine zweistündige Inkubation mit Schaukeln. Am Ende der Inkubation die Perlen auf einem magnetischen Ständer auf Eis sammeln und PMSF zum verbleibenden Polysomenextraktionspuffer hinzufügen. Nach dem Wegwerfen der Überräube, fügen Sie den Proben etwa fünf Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu und setzen Sie die Perlen innerhalb der Proben mit sanftem Kippen wieder auf.Die Proben 15 Minuten lang auf dem Shaker auf Eis schaukeln, gefolgt von zwei Wäschen mit frischem Waschpuffer auf dem Magneten, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Proben in einem Milliliter Waschpuffer in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Und sammeln Sie die Perlen noch einmal auf dem magnetischen Ständer, um alle Überstand zu entfernen.Legen Sie dann die Rohre auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind. Für die Instandsetzung der Labormaterialien, zuerst spülen Sie alle Geräte in den chemischen Abfall. Die Mörser, Stößel und Homogenisatoren mit Seife von Hand waschen, bevor sie jedes Instrument gründlich spülen.Als nächstes legen Sie die Ausrüstung in einen hitzebeheizten Behälter und backen die Materialien über Nacht bei mehr als 220 Grad Celsius. Bürsten Sie alle Zentrifugenrohre mit Reinigungsmittel reinigen, bevor Sie die Rohre auf eine autoklavierbare Schale mit einer Felge und einer Dunstabzugshaube legen. Gießen Sie drei bis 18 Stunden lang einen Milliliter flüssiges Diethylpyrocarbonat und einen Liter deionisierte Wasserlösung auf die Rohre.Dann sammeln Sie die Lösung, bevor Sie die Schale der Rohre im Autoklaven sterilisieren. Hier werden repräsentative Anlagen mit GFP-Signalen gezeigt. Die Gegenfärbung mit Propidiumjodid markiert die Zellwandumrisse.Die Linien entsprechen dem Lokalisationsmuster der Endodermis und dem Xylem-Pol-Pericycle. Bei diesen repräsentativen Messungen aus Polysomen-RNA zeigten die meisten Proben einen sehr geringen Abbau, wobei die RNA-Integritätszahlen zwischen neun und zehn reichten. In diesen Graphen können Spuren erfolgreich vorbereiteter Bibliotheken beobachtet werden, die die Robustheit des Verfahrens trotz verkleinerter Reaktionsvolumina hervorheben.Bevor ein genomübergreifender Datensatz erstellt wird, kann TRAP-RNA aus einem Pilotexperiment mit quantitativem RTPCR untersucht werden, um den Behandlungserfolg und/oder die experimentellen Bedingungen sowie die Gewebespezifität zu validieren. In dieser Analyse bestätigte der Test von drei auxin-responsiven Genen eine erfolgreiche Hormoninduktion nach zwei Stunden Behandlung. Gewebespezifische Marker-Genprofile, die aus den Sequenzierungsdaten abgerufen wurden, bestätigten die Zelltypspezifität.Befolgen Sie die Ratschläge guter Praxis, wenn Sie mit RNA umgehen. Arbeiten Sie an einer sterilen Bank, reinigen Sie Ihre Geräte mit RNA-Entfernungslösung, tragen Sie Handschuhe und wechseln Sie sie sofort, wenn sie kontaminiert werden. Achten Sie darauf, alle giftigen Chemikalien und Gase, die während des Verfahrens verwendet wurden, angemessen zu behandeln und zu entsorgen, insbesondere Phenol-DEPC-Chlorgas und flüssiger Stickstoff.Im Portfolio der omic-Studien nimmt TRAP eine wichtige Nische ein und wurde bereits zur Beantwortung vieler biologischer Fragen, insbesondere in der Entwicklungsbiologie, eingesetzt, TRAP hat ein enormes Potenzial.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Entwicklung und Genexpression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...