Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

היינו רוצים להודות ז ' אן קלוד וואלזר של המרכז גיוון גנטי ציריך עבור ייעוץ מומחה מכריע בשלב מוקדם של פרויקט זה. העבודה במעבדה ורמר נתמך על ידי מענק מפרופסור SNF (PP00P3_157524) ו R' צייד ציוד מענק (316030_164086) מן הקרן הלאומית המדע השוויצרי (SNF) הוענק JEMV.

1. שיבוט של טרנסגנים, ייצור ובחירה של קו טרנסגניים
<ol><li>שיבוט המקדם של בחירה בווקטור הערך המתאים. השתמש בשיטת שיבוט מבוססת שילוב מחדש (טבלת חומרים) ושילוב מחדש של היזמים ב-PDONRP4-P1r. שיבוט RPL18 (עם תג האהדה או חלבון פלורסנט של בחירה) באמצעות שכפול מבוסס-מחדש בשילוב ב PDONRP1-P249.<...

אימות תבנית הלוקליזציה של RPL18 חיוני כדי למנוע פרשנות של נתונים מכל ניסוי השמנה היא תבנית הביטוי הנכון של יחידת המשנה הריבוזומתית המתויג. לכן, שילוב של GFP כמו תג אפירופה ל RPL18 מאוד באלגנטיות מאפשר אימות של דפוס הביטוי הרצוי ברציפות, מתחת השבר polysome מן הרקמה אותה. גישות פולשנית יותר ?...

מונע על ידי יישום הגוברת של טכניקות רצף הדור הבא, רזולוציה מרחבית בביולוגיה התפתחותית יכול להיות מוגבר. מחקרים עכשוויים מכוונים לניתוח רקמות למטה לסוגי תאים מיוחדים, אם לא ברמה אחת של תא1,2,3,4. למטרה זו, שפע של שיטות שונות המציאו במשך 50 השנים האחרונות (ראה איור 1a)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
כלים רבים במדעי הצמח הינם עיבודים של טכניקות שהיו חלוץ במחקר בעלי חיים. זה לא המקרה לשיטה שאנו מציגים בפרוטרוט כאן. ב 2005, מצויד ברקע חזק בתרגום חלבון, מעבדה ביילי Serres להנדס ריבוזומלי חלבונים עבור האהדה הבאה טיהור16. לפיכך, הם יכולים להימנע מיצירת פרופיל רב פעמי ומעמיק לעבודה, אשר מבוסס על מעבר באמצעות שיפוע של סוכות ושימש להערכת תרגום הריבוזומים מאזשנות ה-60,18. השיטה מאז המכונה ריבולtional טיהור אהדה (מלכודת)16. לאחר לימודי העברה מוצלחים בצמחים, מלכודת היימן ואח ' לבעלי חיים19 ואחרים הרחיבו את היישום שלה ל-20שמרים, דרוסופילה21, קסנפוס22 ו-דג זברה23,24.
למרות השינוי הגנטי של מערכת המודל הוא תנאי מוקדם עבור השמנה, אשר מגביל את היישום שלה מינים הניתנים לטרנספורמציה גנטית, ניתן בו לרתום התנגדות זו כדי למקד את קבוצות המשנה של תאים, כי הם בעלי עניין מיוחד, ובכל זאת קשה מאוד לבודד מן הרקמה בשלמותה/איבר25 (למשל בצמחים, כל התאים מוחזקים במקומם דרך קירות התא היוצרים את הבסיס של שלד הידרוסטטי26. כדי לשחרר תא צמח ממטריקס זה, מדענים יש גם לחתוך פיזית את התא מתוך הרקמה המקיפה שלה דרך לכידת לייזר מיקרוניתוח (LCM)27 או ביצע העיכול אנזימטי של קירות התא28. בין התאים האחרונים, מה שנקרא פרוטואופרציה, האוכלוסייה של העניין היא בעלת תווית בדרך כלל וניתן להפריד באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS)7. LCM בדרך כלל דורש מדגם להיות קבוע מוטבע שעווה, אשר בסופו של דבר מתדרדר את האיכות של ה-RNA שלה29. FACS מבוססי שיטות להניב RNA באיכות גבוהה, אבל התהליך של protoplasting עצמו מציג הבדלים ביטוי גנים30 ורקמות עם קירות תא משני שונה ועבה הם לשמצה קשה לטפל. כמו-כן, מניחים על תהליכים התפתחותיים רבים בצמחים להסתמך על אותות מכנית ולכן השלמות של קיר התא היא בעלת חשיבות עליונה31. שתי שיטות, אשר להשתמש בקיצור דרך לעקוף בידוד התא על ידי הפעלה ברמה של נוקלאושני, הם מיון גרעיני המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (מאווררים) ובידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים (שלמות). כמו במלכודת, הם משתמשים ביזמים ספציפיים לסוג תא כדי לסמן גרעינים, שלאחר מכן לקבל מועשר באמצעות מיון או למשוך למטה, בהתאמה8,15. האתגר העיקרי עבור כל הגישות הללו היא לקבל די חומר RNA מקבוצות המשנה של תאים ברקמה. כמו המלכודת לוכדת רק חלק של RNAs הסלולר, אוסף לדוגמה הוא צוואר בקבוק משמעותי. לפיכך, דרושות במיוחד פרוטוקולי הכנה לספריה הרגישים כדי להפיק נתונים באיכות גבוהה מכמויות קלט נמוכות.
מאז הקמתה, המלכודת כבר נעשה שימוש בשילוב עם מיקרו מערכים DNA או, כמו עלויות רצף ירד באופן משמעותי בשנים האחרונות, RNA-seq10,32,33. הרבה שאלות מחקר כבר הובהר כפי שנסקרו בסאבלוק ואח '.34. אנחנו משוכנעים כי דוחות יותר יעברו בשנים הקרובים כמו הטכניקה היא מאוד תכליתי בעת שילוב יזמים שונים כדי למקד סוגי תאים ספציפיים. בסופו של דבר, זה ייעשה גם בדרך inducible, והוא עשוי להיות משולב עם בדיקת תגובת הצמח לגורמי סטרס ביוטיים ובין רבים. בנוסף, כאשר קווים הטרנסגניים יציבה אינם זמינים, מערכות שעירות ביטוי השורש יש גם בהצלחה לבצע מלכודת עגבניות ותרופות35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> איור 1: מתרגם הריבוכמה אהדה (השמנה) משלים את תיק הניתוח "omics". A. הגדלת רמות של דיוק אנליטי, עד תא יחיד או אפילו ברזולוציה subcellular יכול להיות מושגת על ידי שפע של שיטות או שילובים מהם. התוכנית מעניקה סקירה של הכלים הזמינים כעת בתחום הצמח ובעלי החיים. אוסף רקמות ברזולוציה התאית יכול להיות מושגת על ידי פרוטוקולים כמו LCM או FACS, אשר מצמידים לאחר מכן להמרה סטנדרטי או polysome בדיקת פרופיל/translatome. מלכודת ושלמות לשלב לכידת רקמות בידוד RNA כפי שהם מבוססים על התיוג האפיפי. עם זאת, דגימות שלמות רק גרעיני התא ומהווה, לכן, מקרה מיוחד של ניתוח ההמרה. סמל ארנב קטן מסמן שיטות שפותחו לאחרונה בשדה בעלי חיים: בעוד סלאם-itseq ו flura-seq להסתמך על יקוד מטבולית של rnas מחדש עם שינוי אורציל בתאים ביטוי האנזים מאשרני, שקופית-seq עושה שימוש בשקופית זכוכית מצופה עם ברקודים DNA המספקים מידע מיקומני ב הגישה תיוג הקרבה מלווה איפקס-seq כדי לדגום RNAs בתאי subcellular ספציפיים. בעיקר, רזולוציה מוגברת לעתים קרובות דורש את הדור של החומר הטרנסגניים (כוכביות) ושיטות אלה משמשות בעיקר עבור מינים מודל. המלכודת מתאימה במיוחד עבור מדעי הצמח לימודי מעורבים קיר תא (CW) או איתות מכונאי, כמו גם מינים תאים שקשה לשחרר מתוך מטריצה CW שלהם. ב. מפורט שלבי המעבדה הרטובה של הליך המלכודת: השתילים מבטאים חלבון מתויג מסוג gfp בסוגים שונים של תאים (כגון אנדודרסיס שורש) גדלים על מנות פטרי במשך שבעה ימים וחומר שורש שנקטפו על ידי הקפאת ההקפאה. מדגם סה כ בקרת RNA נאסף מתוך תמצית גולמי הומוגניים לפני הפלטינג פסולת באמצעות צנטריפוגה. חרוזים אנטי-GFP מגנטיים נוספים לתמצית נקי לבצע immunoprecipitation. לאחר הדגירה ושלושה צעדים לשטוף, ה-RNA polysome הקשורים (מלכודת/polysome RNA) הוא קיבל ישירות באמצעות כלורופורם פנול-הכלורופורם. LCM: לכידת לייזר מיקרודיסקציה, FACS/אוהדים: תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית/מיון גרעיני, איפקס-seq: שיטה המבוססת על הנדסה ascorbate peroxidase, שלמות: בידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים, סלאם-ITseq: thiol (SH)-האלקילציה מקושרת עבור רצף חילוף החומרים של RNA ברקמות, Flura-seq: fluorouracil-התווית ברצף RNA (נוצר עם Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>
המטרה של מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של שיטת TRAP, כדי להדגיש שלבים קריטיים ולספק הדרכה לשיטת הכנה לספריה אפשרית.
ניסוי המלכודת הגנרית יהיה למעשה מורכב השלבים הבאים (ראה גם איור 1B): (1) הכנת חומר הצמח כולל שיבוט של ריבוכמה תיוג בניית, הייצור קו טרנסגניים ובחירה, גדל ו bulking של זרעים, עיקור וציפוי, ומתח יישום/טיפול (אופציונלי) ו לקצור רקמות; (2) אימונופיקציה, כולל המגון רקמות וניקוי של תמצית גסה, שטיפת חרוזים ואימונופיקציה, ולשטוף את הצעדים; (3) הערכת הוצאת רנ א ואיכות; ו (4) הכנה לספרייה.
שורש arabidopsis כבר מערכת מודל ללמוד פיתוח הצמח מאז המבוא שלה כמפעל דגם37,38. כאן, היישום של המלכודת הוא לראווה בהקשר של פיתוח השורש הצמח לרוחב. בצמחים, הצטברות של מערכת השורש כולה מסתמך על ביצוע של תוכנית זו ולכן חשוב מאוד להישרדותו של האורגניזם39. באראידאופזיס, שורשי הצדדיים מקורם ברקמת כלקרום העור השוכנת ליד כלי הדם ולכן הוא כינה את המוט הקרום (xpp; ראה איור 2 ג)40. כמה תאים XPP, אשר נמצאים עמוק בתוך השורש, לרכוש זהות תא מייסד, על גורם הורמונלי מקומי, להתחיל להתרבות על ידי נפיחות וחילוק אנטיליבאלי41. עם זאת, בשל נוכחותם של מטריצת קיר נוקשה התא, תהליך זה מפעילה לחץ מכני על הרקמות הסובבות. בפרט, אנדודראמיס הנמצא במעלה מושפע, כפי שהוא בדרך של ציר צמיחה שורש לרוחב42,43,44. אכן, החדש הקמתה החדשה יהיה צריך לצמוח דרך התאים האנדודרסטיות האלה (איור 2c2) בעוד תאי הקליפה והאפידרמיס הם רק דחפו הצידה הפריבדיום לבסוף לצאת45,46. העבודה האחרונה במעבדה שלנו הראתה כי האנדודרסטיות תורמת באופן פעיל כדי להכיל את השגשוג בקרום הלב. חסימה ממוקדת של איתות הורמונלי אנדועורי מספיק כדי לעכב גם את החלוקה הראשונה מאוד בתאים XPP47. לפיכך, התקשורת האנדוציציסטית מהווה מחסום מוקדם מאוד לפיתוח השורש הרוחבי בערידרופזיס. עם זאת, לא ידוע כיצד מבוצע הוצלב הזה. כדי לפתור את התעלומה הזאת, אנחנו בחרנו את הגישה השמנה-seq כדי למקד את התאים XPP וכלי העורי. כדי להעשיר את התאים בתוכנית השורש לרוחב, אנו לחקה את הגורם ההורמונלי על ידי החלת באופן שונה היישום מערכת הקלה אנלוגי (1-נפלוג חומצה אצטית, NAA)48, אשר באותו זמן מותר לפתור באופן זמני את השלב הראשוני של היווצרות השורש הצדדי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

במאמר זה, אנו מעניקים הוראות הידיים על מנת להשיג נתונים טרנסלסיים מסוגים שונים של השורש החדש של שורש השיטה באמצעות הריבותרגום האהדה (השמנה) שיטה ומיטוב רצופות הכנה לספרייה נמוכה.
כחומר מתחיל, אנו מעסיקים קווי צמחים לבטא GFP-tagged חלבון RPL18 באופן ספציפי סוג תא על ידי שימוש ביזמים נאותים. לפני החילוץ והפקת ה-RNA, הרקמה מוקפאת, השומרת על שלמות הרקמה ובמקביל מאפשרת ביצוע מחקרי סדרת זמן ברזולוציה גבוהה. בעיקר, מבנים קיר התא נשארים ללא פגע, אשר הוא חיסרון משמעותי בהליכים חלופיים כגון מיון המופעל על-ידי תאים בעלי קרינה פלואורסצנטית מבוסס הגישה הנשענת על רקמות לבודד אוכלוסיות תאים נפרדות. בנוסף, אין קיבעון רקמות הכרחי כמו לכידת לייזר מבוססי מיקרוניתוח טכניקות, אשר מאפשר RNA באיכות גבוהה לקבל.
עם זאת, דגימה מאוכלוסיות משנה של תאים ורק בידוד polysome הקשורים RNA מגביל באופן חמור תשואות RNA. לכן, יש צורך להחיל שיטות רגישות מספיק לספרייה לרכישת נתונים מוצלחת על-ידי RNA-seq.
השמנה מציעה כלי אידיאלי עבור מחקר הצמח כמו תהליכים התפתחותיים רבים כרוך תאים הקשורים לקיר ומכני איתות. השימוש ביזמים למקד אוכלוסיות תאים ספציפיות הוא גישור הפער בין איבר ורמת תא בודד, כי בתורו סובלים מרזולוציה קטנה או עלויות גבוהות מאוד. כאן, אנו להחיל את המלכודת ללמוד תקשורת תא התא במערך השורש הצדדי.

להערכת איכות, ההליך הנ ל צריך להיות נחקר בשלבים ביניים מספר: אימות תבנית ביטוי בplanta, בקרת איכות של RNA polyזומבית מבודדים כמו גם של ספריות הסופי. רביעיית ה-PCR משתמש בגנים הידועים של סמן יכול, בנוסף, להתבצע כדי לאשר את התגובה למצב הטיפול או כדי לכוונן את התנאים הניסיוניים.
<p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

עם TRAP, אנו יכולים לחקור עיבוד התפתחותי ברזולוציה סלולרית. אנו משתמשים ביזמים ספציפיים לתאים כדי לנהוג בתת-יחידה ריבוזומלית מתויגת, משם אנו יכולים לבודד RNA פוליזום. פרוטוקול זה מניב RNA באיכות גבוהה, אך בכמויות מוגבלות מאוד, לכן, שיטות המתמחות בקלט אולטרה נמוך נדרשות כדי לייצר באופן אמין ספריות RNA באיכות גבוהה.TRAP הוא כלי אידיאלי לחקר הצמח, כי תהליכים התפתחותיים רבים מסתמכים על מסלולי איתות הקשורים לקיר התא ומכאני. אנו משתמשים ב- TRAP כדי לחקור תקשורת תאים-תאים במבנה שורשים בין-תאיים. כמו קבלת RNA באיכות טובה הוכיח לא ישר קדימה כפי שציפינו, אנו מקווים כי הוראת וידאו צעד אחר צעד זה יגדיל את ישימות TRAP ולעזור לקדם טכניקה רבת עוצמה זו.כדי לעקר את הקווים הומוזיגיים מופצים, להפיץ פחות מ 300 microliters של זרעים באופן שווה על 12 על ידי 12 ס"מ בריבוע צלחות פטרי, לערום את הכלים על 60 ליטר desiccator. לאחר עיקור גז לילה, תן לגז להתאדות לפני איסוף הזרעים לתוך צינור אחסון 50 מיליליטר. לפני ציפוי, לדלל את הזרעים מעוקרים עם 0.1% אגר כדי לקבל מיליליטר אחד של תערובת זרעים חד-סיבית לכל צלחת.כדי לרכך את תערובת הזרעים, השתמשו במכסי צלחת פטרי מרובעים ליצירת מחזיק תבנית למין לשתילת שלוש שורות זרעים לצלחת, והכנסו צלחות אגר ריקות למחזיק התבנית. מפיצים מיליליטר אחד של הזרעים המוטבעים באופן שווה על שלוש שורות של צלחות. ומ מניחים את הצלחות המעובדות בערימות בזרימה למינארית, עד שהזרעים יבשים.כאשר זרעים נדבקו לפני השטח של אגר, לסגור את המכסים ולאטום כל צלחת עם סרט מיקרופור. לטיפול אקסוגני בשורשי Arabidopsis עם סוכן של עניין, להכין 1.5 עד שני סנטימטר רחב, 10 סנטימטר ארוך, רצועות של נייר טישו. משרים את נייר הרקמה ב-10 מיקרומולרים NAA, ולהשתמש פינצטה כדי להחיל רצועה של נייר טישו על כל שורה של שורשים.לאחר מכן, בעדינות ללחוץ את כל בועות האוויר, ולרוקן את הנוזל העודף מהצלחת, לפני תיוג הצלחת עם הזמן. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במקלפים כדי להסיר בזהירות את רצועות נייר הרקמה מכל צלחת מבלי לנתק את השורשים, ולהשתמש בלהב כירורגי כדי לחתוך פעם אחת בכל שורה לאורך צומת שורש הירי, בשבץ נחוש אחד. השתמש פינצטה כדי להחליק לאורך השורשים של כל שורה, כדי לאסוף את השורשים בשלוש חבילות.ולרוקן את השורשים לתוך צינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי, להקפאת הצמד. כאשר כל דגימות השורש לכל טיפול נאספו, decant חנקן נוזלי עודף באמצעות מכסה הצינור כדי למנוע את השורשים לשפוך. ומ מניחים את הצינור לתוך כלי עושה, לאחסון 80 מעלות צלזיוס.לטחינת רקמות ולהומוגניזציה, לבשו כפפות כותנה תחת כפפות מעבדה סטנדרטיות, והוסיפו PMSF למאגר מיצוי הפוליסום. רוקנו את דגימת הרקמה לתוך מרגמה המכילה חנקן נוזלי, ולהשתמש עלה מקורר לטחון בזהירות את הרקמות עד שכל החומר מופיע כמו אבקה לבנה. כאשר כל הרקמה כבר הקרקע, להוסיף חמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פולאזום לדגימה, במהירות לערבב את שברי רקמה קפואה עם האבקה לפני המאגר קופא.ברגע שניתן להעביר את התערובת, רוקנו את התרסיס לתוך הומוגניזר זכוכית על קרח, ולהשתמש בשני מיליליטר נוספים של חיץ מיצוי פוליוזום כדי לשטוף את המרגמה ואת העלי. לטחון ידנית את תרחיף עד התמצית היא הומוגנית. לאחר מכן, יוצקים את תמצית השורש הגולמי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח, ולעבד את המדגם הבא כפי שהוכח.עבור איסוף RNA כולל, העבר 200 אליקוטים מיקרוליטר של כל מדגם גולמי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים נקיים, מקוררים מראש ומסומנו. כדי להסיר קירות תאים, פסולת, ואברונים גדולים, צנטריפוגה הדגימות ו decant את supernatant לתוך צינורות חרוט טריים, מקורר מראש עבור צנטריפוגה שנייה. בעוד הצינורות מסתובבים, aliquot 60 microliters של חרוזי GFP מגנטיים לכל מדגם, לתוך צינור 1.5 מיליליטר.ולמקום את הצינור על מעמד מגנטי, כדי להקל על הסרה על טבעית. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים במיליליטר אחד של חיץ לשטוף קר לכל לשטוף, ולהשעות מחדש את חרוזים 60 microliters של חיץ לשטוף לכל מדגם. מיד לאחר הצנטריפוגה, decant supernatant פינה לתוך שכותרתו צינורות 15 מיליליטר, ולהוסיף 60 microliters של חרוזים שטף לכל מדגם.לאחר מכן, מניחים את כל הדגימות אופקית לתוך דלי קרח, עבור דגירה של שעתיים עם נדנדה. בסוף הדגירה, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי על קרח, ולהוסיף PMSF למאגר מיצוי פולים הנותרים. לאחר השלכת supernatants, להוסיף כחמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פוליאזום לדגימות, ולהשעות מחדש את חרוזים בתוך הדגימות עם הטיה עדינה.רוק הדגימות במשך 15 דקות על שייקר על קרח, ואחריו שתי שטיפות עם חיץ לשטוף טרי על המגנט, כפי שהודגם. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ לשטוף, לתוך צינור 1.5 מיליליטר. ולאסוף את חרוזים עוד פעם אחת על הדוכן המגנטי, כדי להסיר את כל העל טבעי.לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח עד שכל הדגימות עובדו. לתיאום אספקת המעבדה, ראשית, שטפו את כל הציוד לפסולת הכימית. לשטוף את הידיים את המרגמות, העלים וההומוגניזרים בסבון, לפני שטיפת כל מכשיר ביסודיות.לאחר מכן, מניחים את הציוד במיכל בטוח לחום, ואופים את החומרים לילה מעל 220 מעלות צלזיוס. מברישים את כל צינורות הצנטריפוגה נקיים עם חומר ניקוי, לפני הנחת הצינורות על מגש autoclaveable עם שפה מכסה המנוע אדים. יוצקים מיליליטר אחד של דיתיל פירוקרבונט נוזלי וליטר אחד של תותבת מים deionized על הצינורות במשך שלוש עד 18 שעות.לאחר מכן, לאסוף את הפתרון לפני עיקור מגש של צינורות autoclave. כאן, מוצגים צמחים מייצגים עם אותות GFP. כתם נגדי עם יודיד פרופיד מסמן את קווי המתאר של קיר התא.הקווים תואמים לתבנית לוקליזציה של האנדידרמיס, ולקרסיקל הקוטב הקסים. במדידות מייצגות אלה שהתקבלו מ- RNA פוליזיום, רוב הדגימות הראו השפלה מועטה מאוד, עם מספרי שלמות RNA הנעים בין תשעה ל -10. בגרפים אלה, ניתן לראות עקבות של ספריות שהוכנו בהצלחה, המדגישות את החוסן של ההליך, למרות נפחי תגובה מוקלדים.לפני הפקת ערכת נתונים פורשת גנום, TRAP RNA מניסוי פיילוט ניתן לחקור על ידי RTPCR כמותי כדי לאמת את הצלחת הטיפול ו / או את התנאים הניסיוניים, כמו גם את הספציפיות של הרקמה. בניתוח זה, הבדיקה של שלושה גנים מגיבים לאוקסין אישרה אינדוקציה הורמונלית מוצלחת לאחר שעתיים של טיפול. פרופילי גנים ספציפיים לרקמות שאוחזרו מנתוני רצף אישרו את הספציפיות של סוג התא.בצע ייעוץ תרגול טוב כאשר אתה מטפל RNA. לעבוד על ספסל סטרילי, לנקות את הציוד שלך עם פתרון להסרת RNA, ללבוש כפפות מיד לשנות אותם כאשר הם מקבלים מזוהמים. הקפד לטפל כראוי להשליך את כל הכימיקלים והגזים הרעילים ששימשו במהלך ההליך, במיוחד גז כלור פנול-DEPC וחנקן נוזלי.בפורטפוליו של מחקרים אומיים, TRAP תופסת נישה חשובה, וכבר שימשה כדי לענות על שאלות ביולוגיות רבות, במיוחד בביולוגיה התפתחותית, TRAP יש פוטנציאל עצום.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; ביטוי פיתוח וג&#39;ין

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...