Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरण में महत्वपूर्ण विशेषज्ञ सलाह के लिए आनुवंशिक विविधता केंद्र ज्यूरिख के जीन-क्लाउड वालसर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। वर्मीयर लैब में काम को जेएमवी को सम्मानित स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएसएफ) से एसएनएफ प्रोफेसरशिप ग्रांट (PP00P3_157524) और एक आर लैस उपकरण अनुदान (316030_164086) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. ट्रांसजीन, ट्रांसजेनिक लाइन उत्पादन और चयन की क्लोनिंग
<ol><li>उचित प्रवेश वेक्टर में पसंद के प्रमोटर क्लोन। एक पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग विधि(सामग्री की तालिका)का उपयोग करें और pDONRP4-P1r. क्लोन RPL18 (?...

आरपीएल18 स्थानीयकरण पैटर्न का सत्यापन किसी भी ट्रैप प्रयोग से डेटा की गलत व्याख्या से बचने के लिए महत्वपूर्ण टैग राइबोसोमल उपइकाई का उचित अभिव्यक्ति पैटर्न है। इसलिए, आरपीएल18 के लिए एक एपिटोप ट...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

इस लेख में, हम अनुवादराइसोम एफ़िनिटी शुद्धि (ट्रैप) विधि और लगातार अनुकूलित कम इनपुट लाइब्रेरी तैयारी के माध्यम से विभिन्न अरबीडोप्सिस थैलियाना रूट सेल प्रकारों से अनुवाद डेटा प्राप्त करने के लिए हाथ पर निर्देश देते हैं।
प्रारंभिक सामग्री के रूप में, हम पौधे की लाइनों को नियोजित करते हैं जो पर्याप्त प्रमोटरों के उपयोग से सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से जीएफपी-टैग किए गए राइबोसोमल प्रोटीन आरपीएल18 को व्यक्त करते हैं। इम्यूनोशुद्धि और आरएनए निष्कर्षण से पहले, ऊतक स्नैप फ्रोजन है, जो ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है और साथ ही उच्च लौकिक संकल्प के साथ समय श्रृंखला अध्ययन के निष्पादन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, सेल दीवार संरचनाएं बरकरार रहती हैं, जो वैकल्पिक प्रक्रियाओं में एक प्रमुख खामी है जैसे फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई-आधारित दृष्टिकोण जो अलग सेल आबादी को अलग करने के लिए ऊतक प्रोटोस्टॉन्स्तक पर भरोसा करते हैं। इसके अतिरिक्त, लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन-आधारित तकनीकों के रूप में कोई ऊतक निर्धारण आवश्यक नहीं है, जो उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को प्राप्त करने की अनुमति देता है।
हालांकि, कोशिकाओं की उपआबादी से नमूना और केवल पॉलीसम से जुड़े आरएनए को अलग करना आरएनए पैदावार को गंभीर रूप से सीमित करता है। इसलिए आरएनए-सीक्यू द्वारा सफल डेटा अधिग्रहण के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील पुस्तकालय तैयार करने के तरीकों को लागू करना आवश्यक है।
ट्रैप पौधे अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है क्योंकि कई विकासात्मक प्रक्रियाओं में सेल दीवार से संबंधित और यांत्रिक सिग्नलिंग रास्ते शामिल हैं। विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करने के लिए प्रमोटरों का उपयोग अंग और एकल-कोशिका स्तर के बीच अंतर को पाट रहा है जो बदले में थोड़ा संकल्प या बहुत अधिक लागत से पीड़ित है। यहां, हम पार्श्व जड़ गठन में सेल-सेल संचार का अध्ययन करने के लिए ट्रैप लागू करते हैं।

गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए, उपर्युक्त प्रक्रिया की जांच कई मध्यवर्ती चरणों में की जानी चाहिए: प्लांटा में अभिव्यक्ति पैटर्न सत्यापन, अलग-थलग पॉलीसोमल आरएनए के गुणवत्ता नियंत्रण के साथ-सा?...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) का अनुवाद करने से अंगों और ऊतकों के न्यूनतम प्रसंस्करण के साथ विकासात्मक कार्यक्रमों को विच्छेदन करने की संभावना प्रदान होती है। प्रोटोकॉल एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल राइबोसोमल उपइकाई के साथ लक्षित कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए पैदावार । डाउनस्ट्रीम विश्लेषण उपकरण, जैसे क्यूआरटी-पीसीआर या आरएनए-सीक्यू, ऊतक और सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रकट करते हैं।

एक सेल प्रकार विशिष्ट पैमाने पर अरबीdopsis थैलियाना रूट विकास की जांच करने के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (ट्रैप) का अनुवाद

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

ट्रैप के साथ, हम सेलुलर संकल्प पर विकासात्मक प्रसंस्करण की जांच कर सकते हैं। हम एक टैग किए गए राइबोसोमल उप-इकाई को चलाने के लिए सेल-टाइप-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करते हैं, और वहां से हम पॉलीसोम आरएनए को अलग कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पैदावार करता है, लेकिन बहुत सीमित मात्रा में, इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए पुस्तकालयों का मज़बूती से उत्पादन करने के लिए अल्ट्रा-कम इनपुट के लिए विशिष्ट तरीकों की आवश्यकता होती है।ट्रैप पौधे अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण है, क्योंकि कई विकास प्रक्रियाएं सेल दीवार से संबंधित और यांत्रिक सिग्नलिंग मार्गों पर निर्भर करती हैं। हम पार्श्व जड़ गठन में सेल-सेल संचार का अध्ययन करने के लिए ट्रैप का उपयोग करते हैं। अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के रूप में सीधे आगे के रूप में हम प्रत्याशित नहीं साबित कर दिया, हमें आशा है कि इस कदम से कदम वीडियो अनुदेश जाल प्रयोज्यता में वृद्धि होगी और इस शक्तिशाली तकनीक को बढ़ावा देने में मदद ।प्रचारित होमोज़िगस लाइनों को निष्फल करने के लिए, 12 सेंटीमीटर चुकता पेट्री व्यंजनों पर समान रूप से बीजों के 300 माइक्रोलीटर से कम फैलाएं, और 60 लीटर डिसिकेटर पर व्यंजनों को ढेर करें। रात भर गैस नसबंदी के बाद, गैस एक ५० मिलीलीटर भंडारण ट्यूब में बीज इकट्ठा करने से पहले लुप्त हो जाना । चढ़ाना से पहले, प्रति प्लेट आत्मसात बीज मिश्रण के एक मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए 0.1% एगर के साथ निष्फल बीज को पतला करें।बीज मिश्रण प्लेट करने के लिए, प्रति प्लेट बीज की तीन पंक्तियों को लगाने के लिए एक टुकड़े टुकड़े में टेम्पलेट धारक बनाने के लिए स्क्वायर पेट्री डिश लिड का उपयोग करें, और टेम्पलेट धारक में खाली आगर प्लेटें रखें। प्लेटों की तीन पंक्तियों पर समान रूप से आत्मसात बीजों का एक मिलीलीटर वितरित करें। और जब तक बीज सूखी न हों, तब तक प्रोसेस्ड प्लेटों को एक लैमिनार प्रवाह में ढेर में रखें।जब बीज आगर की सतह पर अटक गए हैं, तो ढक्कन बंद करें और प्रत्येक प्लेट को माइक्रोपोर टेप के साथ सील करें। ब्याज के एजेंट के साथ अरबीडोप्सिस जड़ों के बहिर्जात उपचार के लिए, 1.5 से दो सेंटीमीटर चौड़ा, 10 सेंटीमीटर लंबी, ऊतक कागज की स्ट्रिप्स तैयार करें। ऊतक कागज को 10 माइक्रोमोलर एनएए में भिगो दें, और जड़ों की प्रत्येक पंक्ति में ऊतक कागज की एक पट्टी लागू करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।फिर, धीरे से किसी भी हवा बुलबुले बाहर प्रेस, और थाली से अतिरिक्त तरल खाली, समय के साथ थाली लेबलिंग से पहले । उपयुक्त प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर, जड़ों को अलग किए बिना प्रत्येक प्लेट से ऊतक पेपर स्ट्रिप्स को ध्यान से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और एक निर्धारित स्ट्रोक में शूट-रूट जंक्शन के साथ प्रति पंक्ति एक बार काटने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें। तीन बंडलों में जड़ों को इकट्ठा करने के लिए, प्रत्येक पंक्ति की जड़ों के साथ स्वाइप करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।और एक ५० मिलीलीटर तरल नाइट्रोजन से भरा ट्यूब में जड़ों खाली, स्नैप ठंड के लिए । जब उपचार के अनुसार जड़ नमूनों के सभी एकत्र किया गया है, अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन ट्यूब ढक्कन का उपयोग करने के लिए फैल से जड़ों को रोकने के लिए decant । और ट्यूब को 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए एक कर्ता पोत में रखें।ऊतक पीसने और समरूपता के लिए, मानक प्रयोगशाला दस्ताने के तहत कपास दस्ताने पहनें, और पॉलीसोम निष्कर्षण बफर में पीएमएसएफ जोड़ें। ऊतक के नमूने को तरल नाइट्रोजन युक्त मोर्टार में खाली करें, और ऊतकों को ध्यान से पीसने के लिए एक ठंडा मूसल का उपयोग करें जब तक कि सभी सामग्री सफेद पाउडर के रूप में दिखाई न दे। जब ऊतक के सभी जमीन गया है, नमूना करने के लिए पॉलीसोम निष्कर्षण बफर के पांच मिलीलीटर जोड़ें, और जल्दी से बफर जमा देता से पहले पाउडर के साथ जमे हुए ऊतक टुकड़े मिश्रण ।जैसे ही मिश्रण को स्थानांतरित किया जा सकता है, घोल को बर्फ पर एक ग्लास समरूप में खाली करें, और मोर्टार और मूसल को कुल्ला करने के लिए पॉलीसोम निष्कर्षण बफर के अतिरिक्त दो मिलीलीटर का उपयोग करें। जब तक अर्क समरूप न हो जाए तब तक घोल को मैन्युअल रूप से पीस लें। फिर, बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कच्चे तेल की जड़ निकालने डालो, और प्रदर्शन के रूप में अगले नमूने की प्रक्रिया।कुल आरएनए संग्रह के लिए, प्रत्येक कच्चे तेल के नमूने के 200 माइक्रोलीटर एलिकोट्स को व्यक्तिगत स्वच्छ, पूर्व-शीतलित, लेबल वाले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सेल दीवारों, मलबे और बड़े ऑर्गेनेल्स को हटाने के लिए, नमूनों को अपकेंद्री करें और एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए ताजा, पूर्व-कूल्ड शंकु ट्यूबों में सुपरनेटेंट को डिकंट करें। जबकि ट्यूब घूमते हैं, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में प्रति नमूना चुंबकीय GFP मोती के ६० माइक्रोलीटर aliquot ।और एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब जगह है, सुपरनैंट हटाने की सुविधा के लिए । फिर, प्रति वॉश कोल्ड वॉश बफर के एक मिलीलीटर में दो बार मोतियों को धोएं, और प्रति नमूना वॉश बफर के 60 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें। अपकेंद्रित्र के तुरंत बाद, 15 मिलीलीटर ट्यूबों को लेबल करने में मंजूरी दे दी सुपरनेट को डिकेंट करें, और प्रत्येक नमूने में धोए गए मोतियों के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर, सभी नमूनों को क्षैतिज रूप से एक बर्फ बाल्टी में रखें, कमाल के साथ दो घंटे इनक्यूबेशन के लिए। इनक्यूबेशन के अंत में, बर्फ पर एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों को इकट्ठा करें, और शेष पॉलीसोम निष्कर्षण बफर में पीएमएसएफ जोड़ें। सुपरनेटेंट्स को छोड़ने के बाद, नमूनों में लगभग पांच मिलीलीटर पॉलीसोम निष्कर्षण बफर जोड़ें, और कोमल झुकाव के साथ नमूनों के भीतर मोतियों को फिर से निलंबित करें।बर्फ पर शेखर पर 15 मिनट के लिए नमूनों रॉक, चुंबक पर ताजा धोने बफर के साथ दो धोता के बाद, के रूप में प्रदर्शन किया । अंतिम धोने के बाद, नमूनों को वॉश बफर के एक मिलीलीटर में 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। और सभी सुपरनेट को हटाने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर एक और समय मोतियों को इकट्ठा करें।फिर, ट्यूबों को बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि सभी नमूनों पर कार्रवाई न हो जाए। प्रयोगशाला की आपूर्ति की पुनः शर्त के लिए, पहले, रासायनिक कचरे में उपकरणों के सभी कुल्ला । प्रत्येक उपकरण को अच्छी तरह से धोने से पहले, साबुन के साथ मोर्टार, पेस्टल और समरूपता को धोएं।इसके बाद, उपकरण को गर्मी-सुरक्षित कंटेनर में रखें, और रात भर सामग्री को 220 डिग्री सेल्सियस से अधिक पर बेक करें। एक रिम और एक धुएं हुड के साथ एक ऑटोक्लेवेबल ट्रे पर ट्यूब रखने से पहले, डिटर्जेंट के साथ साफ अपकेंद्रित्र ट्यूबों के सभी ब्रश । तीन से 18 घंटे के लिए ट्यूबों पर तरल डायथिल पायरोकार्बोनेट और एक लीटर डिओनाइज्ड पानी के समाधान का एक मिलीलीटर डालें।इसके बाद ऑटोक्लेव में ट्यूबों की ट्रे को स्टरलाइज करने से पहले घोल इकट्ठा करें। यहां, जीएफपी संकेतों वाले प्रतिनिधि संयंत्र दिखाए जाते हैं। प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ काउंटर-धुंधला सेल दीवार रूपरेखा को चिह्नित करता है।रेखाएं एंडोडरमिस के स्थानीयकरण पैटर्न और दारू-ध्रुव पेरिसाइकिल के अनुरूप हैं। पॉलीसोम आरएनए से प्राप्त इन प्रतिनिधि मापों में, अधिकांश नमूनों में बहुत कम गिरावट दिखाई दी, जिसमें आरएनए अखंडता संख्या नौ से लेकर 10 तक थी । इन रेखांकनों में, सफलतापूर्वक तैयार पुस्तकालयों के निशान देखे जा सकते हैं, प्रक्रिया की मजबूती को रेखांकित करते हुए, स्केल्ड-डाउन रिएक्शन वॉल्यूम के बावजूद।जीनोम-फैले डेटासेट का उत्पादन करने से पहले, एक प्रायोगिक प्रयोग से ट्रैप आरएनए को उपचार की सफलता और/या प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ-साथ ऊतक विशिष्टता को मान्य करने के लिए मात्रात्मक आरटीपीसीआर द्वारा जांचा जा सकता है । इस विश्लेषण में तीन ऑक्सिन-उत्तरदायी जीन के परीक्षण से दो घंटे के इलाज के बाद एक सफल हार्मोन इंडक्शन की पुष्टि हुई। अनुक्रमण डेटा से प्राप्त ऊतक-विशिष्ट मार्कर जीन प्रोफाइल ने सेल-प्रकार विशिष्टता की पुष्टि की।जब आप आरएनए को संभालते हैं तो अच्छी अभ्यास सलाह का पालन करें। एक बाँझ बेंच पर काम करें, आरएनए-हटाने वाले समाधान के साथ अपने उपकरणों को साफ करें, दस्ताने पहनें और दूषित होने पर तुरंत उन्हें बदलें। प्रक्रिया के दौरान उपयोग किए गए सभी जहरीले रसायनों और गैसों, विशेष रूप से फिनॉल-डीईपीसी क्लोरीन गैस और तरल नाइट्रोजन को उचित रूप से संभालना और त्यागना सुनिश्चित करें।ओमिक अध्ययन के पोर्टफोलियो में, ट्रैप एक महत्वपूर्ण जगह पर है, और पहले से ही कई जैविक सवालों के जवाब देने के लिए उपयोग किया जा चुका है, विशेष रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान में, ट्रैप में एक विशाल क्षमता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic क्षेत्र (GMF) और संयंत्र विकास: GMF उत्क्रमण के प्रभाव पर जांच<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; विकास और जीन एक्सप्रेशन

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

विश्लेषण<em&gt; Vivo</em&gt; सेल प्रवास zebrafish भ्रूण में सेल प्रत्यारोपण और समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

प्रतिलेखन कारक के साथ माउस भ्रूणीय Fibroblasts Reprogramming एक Hemogenic कार्यक्रम प्रेरित करने के लिए

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

सीमित तत्व मॉडल के निर्माण Zebrafish जबड़ा बायोमैकेनिक्स जांच

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

रूट और हाइपोकॉटल विकास के दीर्घकालिक कन्फोकल इमेजिंग के लिए एक सरल चैंबर

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

सेल भेदभाव के दौरान मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेस पाथवे के प्रकाश-मध्यस्थतापूर्ण प्रतिवर्ती मॉडुलन और<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण विकास

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

इन विट्रो Arabidopsis थालियाना में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए बीजांड खेती

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

वीवो में Trypanosoma cruzi गतिशीलता की जांच के लिए एक पशु मॉडल के रूप में लार्वा Zebrafish की स्थापना

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...