Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Ringraziamo Jean-Claude Walser del Centro per la diversità genetica di zurighese per la consulenza di esperti cruciali nella prima fase di questo progetto. Il lavoro nel laboratorio di Vermeer è stato sostenuto da una sovvenzione di professori SNF (PP00P3_157524) e da una sovvenzione per attrezzature R'EQUIP (316030_164086) della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNSF) assegnata a JEMV.

1. Clonazione di transgenici, produzione e selezione di linee transgeniche
<ol><li>Clonare il promotore di scelta nel vettore di immissione appropriato. Utilizzare un metodo di clonazione basato sulla ricombinazione (Table of Materials) e ricombinare i promotori in pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (con tag di affinità o proteina fluorescente prescelta) utilizzando la clonazione basata sulla ricombinazione in pDONRP1-P249.</li>
	<li>Combinare il vettore di ingresso contenente RPL18<...

Verifica del modello di localizzazione RPL18 Fondamentale per evitare interpretazioni errate dei dati di qualsiasi esperimento TRAP è il modello di espressione corretto della sottounità ribosomica con tag. Pertanto, l'incorporazione di GFP come tag epitope a RPL18 consente molto elegantemente la verifica del modello di espressione desiderato e consecutivamente, la pulldown della frazione polisoma dallo stesso tessuto. Approcci più invasivi per assicurare modelli di promotore adeguati sono seguiti d...

Spinto dalla crescente applicazione delle tecniche di sequenziamento di prossima generazione, la risoluzione spaziale nella biologia dello sviluppo potrebbe essere aumentata. Studi contemporanei mirano a sezionare i tessuti verso il basso per tipi di cellule specializzate, se non il livello a cella singola1,2,3,4.4 A tal fine, negli ultimi cinquant'anni è stata ideata una pletora di metodi diversi (vedi Figura 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Molti strumenti nella scienza delle piante sono stati adattamenti di tecniche che sono state introdotte nella ricerca animale. Questo non è il caso per il metodo che stiamo introducendo in dettaglio qui. Nel 2005, dotato di un forte background nella traduzione delle proteine, il Bailey-Serres Lab ha deciso di progettare proteine ribosomiche per la successiva purificazione dell'affinità16. Così, potrebbero evitare la profilazione polisografica lunga e laboriosa, che si basa sull'ultracentrifugazione con un gradiente di saccarosio ed è stato utilizzato per valutare i ribosomi traslitteranti dal 196017,18. Da allora il metodo è stato indicato come trap (Affinity purificazione)16. Dopo studi translatomi di successo in piante, Heiman et al. adattato TRAP per gli animali19 e altri esteso la sua applicazione al lievito20, Drosophila21, Xenopus22 e pesce zebra23,24.
Anche se la modificazione genetica del sistema modello è un prerequisito per il TRAP, che limita la sua applicazione alle specie suscettibili di trasformazione genetica, si può allo stesso tempo sfruttare questa obiezione per indirizzare sottoinsiemi di cellule che sono di particolare interesse e altrimenti estremamente difficili da isolare dal tessuto intatto / organo25 (ad esempio, cellule dendritiche altamente ramificate in un cervello di topo o iphae fungini intessuto vegetale infetto). Nelle piante, tutte le cellule sono tenute in posizione attraverso pareti cellulari che costituiscono la base dello scheletro idrostatico26. Per liberare una cellula vegetale da questa matrice, gli scienziati hanno fisicamente tagliato la cellula dal tessuto circostante attraverso la microdissezione di cattura laser (LCM)27 o eseguito la digestione enzimatica delle pareti cellulari28. Tra queste ultime cellule, le cosiddette protoplasts, la popolazione di interesse è fluorescente etichettata e può essere separata tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)7. LCM di solito richiede un campione da fissare e incorporare nella cera, che alla fine deteriora la qualità del suo RNA29. I metodi basati su FACS producono RNA di alta qualità, ma il processo di protoplasting stesso introduce differenze nell'espressione genica30 e i tessuti con pareti cellulari secondarie modificate e spesse sono notoriamente difficili da trattare. Inoltre, si presume che molti processi di sviluppo negli impianti si basino su segnali trasmessi meccanicamente e quindi l'integrità della parete cellulare è di fondamentale importanza31. Due metodi, che utilizzano una scorciatoia per aggirare l'isolamento cellulare operando a livello di nucleii, sono lo smistamento nucleare attivato dalla fluorescenza (FANS) e l'isolamento dei nuclei taggati in specifici tipi di cellule (INTACT). Come nel TRAP, usano promotori specifici del tipo di cellula per contrassegnare i nuclei, che successivamente si arricchiscono tramite ordinamento o discesa, rispettivamente8,15. Una grande sfida per tutti questi approcci è ottenere sufficiente materiale di RNA da sottoinsiemi di cellule in un tessuto. Poiché TRAP cattura solo una frazione degli RNA cellulari, la raccolta dei campioni è un notevole collo di bottiglia. Pertanto, sono necessari protocolli di preparazione della libreria particolarmente sensibili per produrre dati di alta qualità da quantità di input basse.
Dalla sua istituzione, TRAP è stato utilizzato in combinazione con microarray di DNA o, come i costi di sequenziamento è sceso in modo significativo negli ultimi anni, RNA-seq10,32,33. Una moltitudine di domande di ricerca è già stato chiarito come esaminato in Sablok et al.34. Siamo convinti che nei prossimi anni seguiranno ulteriori rapporti, poiché la tecnica è molto versatile quando si combinano diversi promotori per indirizzare tipi di cellule specifici. Alla fine, questo sarà fatto anche in modo inducibile, e può essere combinato con sondare la reazione della pianta a molti fattori di stress biotici e abiotici. Inoltre, laddove non sono disponibili linee transgeniche stabili, sono stati utilizzati con successo anche sistemi di espressione delle radici pelose per eseguire trap in pomodoro e medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figura 1: La traduzione della purificazione dell'affinità del ribosomiare (TRAP) integra il portafoglio di analisi "omiche". R. L'aumento dei livelli di precisione analitica, fino alla risoluzione a cella singola o addirittura subcellulare, può essere raggiunto con una pletora di metodi o combinazioni. Il sistema fornisce una panoramica degli strumenti attualmente disponibili nel campo delle piante e degli animali. La raccolta dei tessuti a risoluzione cellulare può essere ottenuta da protocolli come LCM o FACS, che vengono poi accoppiati a trascrittoma standard o all'analisi di profilazione/traslatoma polisomico. TRAP e INTACT integrano sia la cattura dei tessuti che l'isolamento dell'RNA in quanto si basano sull'epitope-tagging. Tuttavia, INTACT campiona solo i nuclei cellulari e costituisce, quindi, un caso speciale di analisi del trascrittoma. Una piccola icona coniglio segna metodi appena sviluppati nel campo animale: Mentre SLAM-ITseq e Flura-seq si basano sul targeting metabolico di RNA nascenti con basi uracili modificate in cellule che esprimono l'enzima permissivo, Slide-seq fa uso di un vetrino di vetro rivestito con codici a barre del DNA che forniscono informazioni posizionali nella gamma cellulare. In APEX-seq è seguito un approccio di etichettatura di prossimità per campionare gli RNA in specifici compartimenti subcellulari. In particolare, una maggiore risoluzione spesso richiede la generazione di materiale transgenico (asterischi) e questi metodi sono quindi utilizzati prevalentemente per le specie modello. Il TRAP è particolarmente adatto per studi di scienze vegetali che coinvolgono la parete cellulare (CW) o la segnalazione meccanica, nonché le specie cellulari che sono difficili da rilasciare dalla loro matrice CW. B. Le fasi dettagliate del laboratorio umido della procedura TRAP: le piantine che esprimono proteine ribosomiche marcate GFP in tipi di cellule distinte (ad esempio l'endodermide delle radici) vengono coltivate sui piatti Petri per sette giorni e il materiale delle radici raccolto dal congelamento a scatto. Un campione totale di controllo dell'RNA viene raccolto dall'estratto grezzo omogeneo prima di pellere i detriti attraverso la centrifugazione. Perline magnetiche anti-GFP vengono aggiunte all'estratto eliminato per eseguire l'immunoprecipitazioni. Dopo l'incubazione e tre fasi di lavaggio, l'RNA associato al poliso (TRAP/RNA polisopo) viene ottenuto direttamente tramite l'estrazione del fenolo-cloroformio. LCM: microdissezione di cattura laser, FACS/FANS: smistamento cellulare/nucleare attivato dalla fluorescenza, APEX-seq: metodo basato su ingegnerizzato ascorbate perossidasi, INTACT: isolamento dei nuclei contrassegnati in specifici tipi di cellule, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alchilirazione per il sequenziamento metabolico dell'RNA nel tessuto, Flura-seq: fluorouracil-labeled RNA sequencing (Creato con Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.</a>
L'obiettivo di questo articolo è fornire una descrizione dettagliata del metodo TRAP, evidenziare i passaggi critici e fornire indicazioni per un possibile metodo di preparazione della libreria.
Un esperimento trap generico consisterà essenzialmente nei seguenti passi (vedi anche Figura 1B): (1) Preparazione del materiale vegetale, compresa la clonazione del costrutto di ribosomi, la produzione e la selezione di linee transgeniche, la coltivazione e l'accumulo di semi, la sterilizzazione e la placcatura e l'applicazione/trattamento dello stress (opzionale) e la raccolta dei tessuti; (2) immunopurificazione, compresa l'omogenesi e la bonifica dei tessuti, il lavaggio delle perline e l'immunopurificazione e le fasi di lavaggio; (3) Estrazione dell'RNA e valutazione della qualità; e (4) la preparazione della biblioteca.
La radice dell'Arabidopsis è stata un sistema modello per studiare lo sviluppo delle piante sin dalla sua introduzione come impianto modello37,38. Qui, l'applicazione di TRAP è presentata nel contesto dello sviluppo delle radici laterali dell'impianto. Nelle piante, l'accumulo dell'intero sistema radicale si basa sull'esecuzione di questo programma ed è quindi molto importante per la sopravvivenza dell'organismo39. In Arabidopsis, le radici laterali provengono dal tessuto periciclo che risiede accanto ai vasi xylem e quindi è chiamato xylem polo periciclo (XPP; vedi Figura 2C)40. Alcune cellule XPP, che si trovano in profondità all'interno della radice, acquisiscono un'identità cellulare fondatore e, su un trigger ormonale locale, iniziano a proliferare gonfiore e dividendo anticlinally41. Tuttavia, a causa della presenza di una matrice rigida della parete cellulare, questo processo esercita uno stress meccanico sui tessuti circostanti. In particolare, l'endodermide sovrastante è interessata, in quanto è nel modo dell'asse di crescita della radice laterale42,43,44. Infatti, il primordio appena formato dovrà crescere attraverso la cellula endodermide sovrastante (Figura 2C2) mentre le cellule corteccia ed epidermide sono solo spinte da parte per il primordio per emergere finalmente45,46. Recenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l'endodermide sta contribuendo attivamente ad accogliere la proliferazione nel periciclo. Il blocco mirato della segnalazione ormonale endodermica è sufficiente per inibire anche la prima divisione nelle cellule XPP47. Pertanto, la comunicazione pericycle-endodermis costituisce un checkpoint molto precoce per lo sviluppo della radice laterale nell'Arabidopsis. Tuttavia, non è noto come questo crosstalk viene eseguito. Per svelare questo mistero, abbiamo scelto l'approccio TRAP-seq per colpire XPP e cellule endodermiche. Per arricchire per le cellule nel programma della radice laterale, abbiamo imitato il trigger ormonale applicando esogenamente un analogo auxina (1-naftaleneacetic acid, NAA)48, che allo stesso tempo ha permesso di risolvere temporaneamente la fase iniziale di formazione della radice laterale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

In questo articolo, diamo istruzioni pratiche per ottenere dati translatomi da diversi tipi di cellule della radice di Arabidopsis thaliana tramite il metodo di purificazione dell'affinità del ribosoma di traduzione (TRAP) e la preparazione consecutiva della libreria a basso input.
Come materiale di partenza, impieghiamo linee vegetali che esprimono RPL18 di proteine ribosomiche marcate tramite GFP in modo specifico del tipo di cellula mediante l'uso di promotori adeguati. Prima dell'immunopurificazione e dell'estrazione dell'RNA, il tessuto viene congelato allo snap, che conserva l'integrità dei tessuti e contemporaneamente consente l'esecuzione di studi di serie temporali ad alta risoluzione temporale. In particolare, le strutture delle pareti cellulari rimangono intatte, il che è uno dei principali inconvenienti nelle procedure alternative come gli approcci basati sullo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza che si basano sulla protonodurata dei tessuti per isolare popolazioni cellulari distinte. Inoltre, non è necessaria alcuna fissazione dei tessuti come nelle tecniche basate sulla microdissezione di cattura laser, che consente di ottenere RNA di alta qualità.
Tuttavia, il campionamento dalle sottopopolazioni di cellule e solo l'isolamento dell'RNA associato al polisomo limita gravemente la resa dell'RNA. È quindi necessario applicare metodi di preparazione della libreria sufficientemente sensibili per una corretta acquisizione dei dati da parte dell'RNA-seq.
TRAP offre uno strumento ideale per la ricerca sulle piante, poiché molti processi di sviluppo coinvolgono percorsi di segnalazione meccanica e correlati alle pareti cellulari. L'uso di promotori per colpire specifiche popolazioni di cellule sta colmando il divario tra il livello di organo e a livello di singola cellula che a sua volta soffrono di poca risoluzione o di costi molto elevati. Qui, applichiamo il TRAP per studiare la comunicazione cellulare nella formazione laterale della radice.

Per la valutazione della qualità, la procedura di cui sopra dovrebbe essere sondata in diversi passaggi intermedi: convalida del modello di espressione nella planta, controllo qualità dell'RNA polisomico isolato e delle librerie finali. QRT-PCR utilizzando geni marcatori noti può, inoltre, essere eseguito per confermare la risposta alla condizione di trattamento o per mettere a punto le condizioni sperimentali.
Analis...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Tradurre la purificazione dell'affinità di ribosomi (TRAP) offre la possibilità di sezionare programmi di sviluppo con una minima elaborazione di organi e tessuti. Il protocollo produce RNA di alta qualità da cellule mirate con una sottounità ribosomica denominata GFP (Proteina fluorescente verde). Gli strumenti di analisi a valle, come qRT-PCR o RNA-seq, rivelano profili di espressione specifici del tessuto e del tipo di cellula.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Con TRAP, possiamo indagare l'elaborazione dello sviluppo a risoluzione cellulare. Usiamo promotori specifici del tipo di cella per guidare una sotto-unità ribosomiale taggata, e da lì possiamo isolare l'RNA polisoma. Questo protocollo produce RNA di alta qualità, ma in quantità molto limitate, quindi, sono necessari metodi specializzati per l'input ultra-basso per produrre in modo affidabile librerie di RNA di alta qualità.TRAP è uno strumento ideale per la ricerca vegetale, perché molti processi di sviluppo si basano su percorsi di segnalazione meccanica e legati alla parete cellulare. Usiamo TRAP per studiare la comunicazione cellula-cellula nella formazione delle radici lateralmente. Poiché ottenere un RNA di buona qualità non è stato così semplice come avevamo previsto, speriamo che questa istruzione video passo-passo aumenti l'applicabilità trap e contribuisca a promuovere questa potente tecnica.Per sterilizzare le linee omozigote propagate, stendere in modo uniforme meno di 300 microlitri di semi su piastre petri quadrate di 12 per 12 centimetri e impilare i piatti su un essiccatore da 60 litri. Dopo la sterilizzazione del gas durante la notte, lasciare evaporare il gas prima di raccogliere i semi in un tubo di stoccaggio da 50 millilitri. Prima della placcatura, diluire i semi sterilizzati con lo 0,1% di agar per ottenere un millilitro di miscela di semi imbibati per piatto.Per placcare il mix di semi, utilizzare coperchi quadrati della piastra di Petri per creare un porta modello laminato per piantare tre file di semi per piatto e posizionare le piastre di agar vuote nel supporto del modello. Distribuire uniformemente un millilitro dei semi imbibati su tre file di piatti. E posizionare le piastre lavorate in pile in un flusso laminare, fino a quando i semi sono asciutti.Quando i semi si sono attaccati alla superficie dell'agar, chiudere i coperchi e sigillare ogni piastra con nastro micropore. Per il trattamento esogeno delle radici di Arabidopsis con un agente di interesse, preparare strisce di carta velina larghe da 1,5 a due centimetri, lunghe 10 centimetri. Immergere la carta velina in NAA micromolare 10 e utilizzare una pinzetta per applicare una striscia di carta velina su ogni riga di radici.Quindi, premere delicatamente eventuali bolle d'aria e svuotare il liquido in eccesso dalla piastra, prima di etichettare la piastra con il tempo. Nel punto finale sperimentale appropriato, utilizzare le forcelle per rimuovere con cura le strisce di carta velina da ogni piastra senza staccare le radici e utilizzare una lama chirurgica per tagliare una volta per fila lungo la giunzione shoot-root, in un singolo tratto determinato. Usa le pinzette per scorrere lungo le radici di ogni riga, per raccogliere le radici in tre fasci.E svuotare le radici in un tubo da 50 millilitri riempito con azoto liquido, per il congelamento a scatto. Una volta raccolti tutti i campioni di radice per trattamento, decantare l'azoto liquido in eccesso utilizzando il coperchio del tubo per evitare che le radici si riversano. E posizionare il tubo in un vaso doer, per uno stoccaggio di 80 gradi celsius.Per la macinazione e l'omogeneizzazione dei tessuti, indossare guanti di cotone sotto guanti da laboratorio standard e aggiungere PMSF al tampone di estrazione polisoma. Svuotare il campione di tessuto in una malta contenente azoto liquido e utilizzare un pestello raffreddato per macinare accuratamente i tessuti fino a quando tutto il materiale appare come polvere bianca. Quando tutto il tessuto è stato macinato, aggiungere cinque millilitri di tampone di estrazione polisoma al campione e mescolare rapidamente i frammenti di tessuto congelato con la polvere prima che il tampone si congeli.Non appena la miscela può essere trasferita, svuotare il liquame in un omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio e utilizzare altri due millilitri di tampone di estrazione poliosoma per risciacquare la malta e il pestello. Macinare manualmente il liquame fino a quando l'estratto non è omogeneo. Quindi, versare l'estratto di radice grezza in un tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio ed elaborare il campione successivo come dimostrato.Per la raccolta totale dell'RNA, trasferire 200 aliquote di microliter di ciascun campione grezzo in singoli tubi di microcentrifugo puliti, pre-raffreddati ed etichettati. Per rimuovere pareti cellulari, detriti e grandi organelli, centrifugare i campioni e decantare il supernatante in tubi conici freschi e pre-raffreddati per una seconda centrifugazione. Mentre i tubi girano, aliquota 60 microlitri di perline magnetiche GFP per campione, in un tubo da 1,5 millilitri.E posizionare il tubo su un supporto magnetico, per facilitare la rimozione del supernatante. Quindi, lavare le perline due volte in un millilitro di tampone di lavaggio freddo per lavaggio e sospendere di nuovo le perline in 60 microlitri di tampone di lavaggio per campione. Immediatamente dopo la centrifugazione, decantare il supernatante autorizzato in tubi etichettati da 15 millilitri e aggiungere 60 microlitri di perline lavate a ciascun campione.Quindi, posizionare tutti i campioni orizzontalmente in un secchio di ghiaccio, per un'incubazione di due ore con dondolo. Alla fine dell'incubazione, raccogliere le perline su un supporto magnetico sul ghiaccio e aggiungere PMSF al tampone di estrazione polisoma rimanente. Dopo aver scartato i supernaganti, aggiungere circa cinque millilitri di tampone di estrazione polisoma ai campioni e sospendere di nuovo le perline all'interno dei campioni con inclinazione delicata.Dondolare i campioni per 15 minuti sullo shaker sul ghiaccio, seguiti da due lavaggi con tampone di lavaggio fresco sul magnete, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i campioni in un millilitro di tampone di lavaggio, in un tubo da 1,5 millilitri. E raccogliere le perline un'altra volta sul supporto magnetico, per rimuovere tutto il supernatante.Quindi, posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati. Per il ricondizionamento delle forniture di laboratorio, in primo luogo, sciacquare tutte le apparecchiature nei rifiuti chimici. Lavare a mano i mortai, i pestelli e gli omogeneizzatori con sapone, prima di risciacquare accuratamente ogni strumento.Quindi, posizionare l'apparecchiatura in un contenitore sicuro per il calore e cuocere i materiali durante la notte a più di 220 gradi celsius. Spazzolare tutti i tubi di centrifuga puliti con detersivo, prima di posizionare i tubi su un vassoio autoclavebile con un cerchio e una cappa aspirante. Versare un millilitro di dietil pirocarbonato liquido e un litro di soluzione d'acqua deionizzata sui tubi per tre o 18 ore.Quindi, raccogliere la soluzione prima di sterilizzare il vassoio dei tubi nell'autoclave. Qui vengono mostrate piante rappresentative con segnali GFP. La contro-colorazione con ioduro di propidio segna i contorni della parete cellulare.Le linee corrispondono al modello di localizzazione dell'endodermide e del periclo xilem-polo. In queste misurazioni rappresentative ottenute dall'RNA poliosoma, la maggior parte dei campioni ha mostrato pochissima degradazione, con numeri di integrità dell'RNA che vanno da nove a 10. In questi grafici, si possono osservare tracce di librerie preparate con successo, evidenziando la robustezza della procedura, nonostante i volumi di reazione ridimensionati.Prima di produrre un set di dati di spanning del genoma, l'RNA TRAP di un esperimento pilota può essere sondato da RTPCR quantitativo per convalidare il successo del trattamento e / o le condizioni sperimentali, nonché la specificità dei tessuti. In questa analisi, il test di tre geni reattivi all'auxina ha confermato un'induzione ormonale di successo dopo due ore di trattamento. I profili genetici marcatori specifici dei tessuti recuperati dai dati di sequenziamento hanno confermato la specificità del tipo di cellula.Segui i consigli sulle buone pratiche quando gestisci l'RNA. Lavora su una panchina sterile, pulisci la tua attrezzatura con la soluzione di rimozione dell'RNA, indossa i guanti e cambiali immediatamente quando vengono contaminati. Assicurarsi di maneggiare e scartare in modo appropriato tutte le sostanze chimiche tossiche e i gas utilizzati durante la procedura, in particolare il gas cloro fenolo-DEPC e l'azoto liquido.Nel portafoglio degli studi omici, TRAP occupa una nicchia importante ed è già stato utilizzato per rispondere a molte domande biologiche, specialmente nella biologia dello sviluppo, trap ha un enorme potenziale.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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