Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

このプロジェクトの初期段階で、チューリッヒ遺伝ダイバーシティセンターのジャン=クロード・ウォルサーに重要な専門家のアドバイスをしてくれたことに感謝します。フェルメール研究所での研究は、スイス国立科学財団(SNSF)からSNF教授助成(PP00P3_157524)とR'EQUIP機器助成金(316030_164086)によって支援されました。

トランスジーン、トランスジェニックラインの生産と選択の1
<ol><li>適切なエントリーベクターで選択したプロモーターをクローン化する。再結合ベースのクローニング法(材料表)を使用し、pDONRP1-P249で再結合ベースのクローニングを使用してpDONRP4-P1r.クローンRPL18(アフィニティータグまたは蛍光タンパク質を選択した)でプロモーターを再結合する。</li>
	<li><em...

RPL18ローカリゼーションパターンの検証 TRAP実験のデータの誤解釈を避けるために重要なのは、タグ付きリボソームサブユニットの適切な発現パターンです。従って、RPL18へのエピトープタグとしてのGFPの組み込みは、所望の発現パターンの検証を非常に優雅に可能にし、連続して、同じ組織からポリソーム分画のプルダウンを可能にする。適切なプロモーターパターンを保証?...

次世代シーケンシング技術の応用の増加によって、発生生物学における空間分解能が増強される可能性があります。現代の研究は、単一細胞レベル,,1、2、3、42ではないにしても、特殊な細胞タイプに組織1を解剖することを目的としています。34この処理のために、過去 50 年間に多数の異なる方法が考案されています (図1A)5、6、,7,、8 、9、109、11、12、13、1414、15.
植物科学の多くのツールは、動物研究で開拓された技術の適応されています。これは、ここで詳しく紹介する方法には当てはまらない。2005年、タンパク質翻訳の強力な背景を備えたBailey-Serres Labは、その後の親和性精製のためにリボソームタンパク質の設計に着手しました。したがって、スクロース勾配を有する超遠心分離に基づく時間と労力を要するポリソームプロファイリングを回避することができ、1960年代17、18,18年以来リボソームの翻訳を評価するために使用された。この方法は、その後、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)16と呼ばれている。植物の翻訳研究に成功した後、Heimanらの動物19と他の人のためのTRAPを適応させた酵母20、ショウジョウバエ21、ゼノプス22およびゼブラフィッシュ23、24,24への応用を拡張した。
モデルシステムの遺伝子改変はTRAPの前提条件であり、その適用を遺伝的変換に適した種に限定しますが、この異議を、特別な関心を持ち、無傷の組織/器官25から分離することが非常に困難な細胞のサブセット(例えば、マウス脳内の高度に分岐した樹状細胞または感染した植物組織の真菌性催眠細胞)に同時に利用することができます。植物では、全ての細胞が、静水性骨格26の基礎となる細胞壁を介して所定の位置に保持される。このマトリックスから植物細胞を解放するために、科学者たちはレーザー捕捉マイクロディション(LCM)27を介して周囲の組織から細胞を物理的27に切断するか、または細胞壁28の酵素消化を行った。後者の細胞の中でも、いわゆるプロトプラストは、目的の集団が蛍光標識され、蛍光活性化細胞選別(FACS)7を介して分離することができる7。LCMは通常、試料を固定してワックスに埋め込む必要があり、最終的にはRNA29の品質が低下する。FACSベースの方法は高品質のRNAを生み出すが、プロプロトバテナのプロセス自体が遺伝子発現30の違いを導入し、改変された厚い二次細胞壁を有する組織は治療が困難であると悪名高い。さらに、植物における多くの発達過程は機械的に伝達される信号に依存すると仮定され、したがって細胞壁の完全性は最も重要である31。核のレベルで動作することによって細胞単離を回避するためのショートカットを使用する2つの方法は、蛍光活性化核選別(FANS)および特定の細胞タイプ(INTACT)でタグ付けされた核の単離である。TRAPのように、彼らは細胞型特異的プロモーターを使用して核をマークし、その後、並べ替えまたはプルダウンを介して濃縮され、それぞれ8,8、15。これらすべてのアプローチの主要な課題は、組織中の細胞のサブセットから十分なRNA材料を得るということです。TRAP は細胞RNAのほんの一部しか捕捉しなかね、サンプル収集は大きなボトルネックです。したがって、特に、低入力量から高品質のデータを生成するためには、機密性の高いライブラリ準備プロトコルが必要です。
その設立以来、TRAPはDNAマイクロアレイと組み合わせて使用されているか、または、シーケンシングコストが近年大幅に低下したため、RNA-seq1010、32、3332,33が使用されている。Sablokら34でレビューされた多数の研究の質問が既に解明されています。我々は、特定の細胞タイプを標的に異なるプロモーターを組み合わせる場合、この技術は非常に汎用性が高いため、今後数年間でより多くの報告が続くと確信しています。最終的には、これは誘導可能な方法でも行われ、多くの生物的および無生物的ストレス要因に対する植物の反応を調査することと組み合わされる可能性があります。さらに、安定したトランスジェニックラインが利用できないところでは、毛深い根発現系もトマトおよびメディカゴ35,36,36でTRAPを行うためにもうまく使用されている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> 図1:リボソームアフィニティー精製(TRAP)の翻訳は、「オミックス」分析ポートフォリオを補完します。A.分析精度のレベルを上げると、単一細胞または細胞内の分解能まで、多くの方法またはそれらの組み合わせによって達成できます。このスキームは、植物および動物分野で現在利用可能なツールの概要を示します。細胞分解能での組織の収集は、LCMやFACSのようなプロトコルによって達成され、標準のトランスクリプトームまたはポリソームプロファイリング/翻訳分析に結合されます。TRAPとINTACTは、エピトープタグに基づいているため、組織捕捉とRNAの分離の両方を統合します。しかしながら、INTACTサンプルは細胞核のみを構成し、したがって、トランスクリプトーム分析の特別な場合を構成する。小さなウサギのアイコンは、動物分野で新たに開発された方法を示しています:SLAM-ITseqとFlura-seqは、寛容な酵素を発現する細胞内の改変ウラシル塩基を持つ新生RNAの代謝ターゲッティングに依存していますが、Slide-seqは、細胞範囲内の位置情報を提供するDNAバーコード付きコーティングガラススライドを使用しています。特定の細胞内区画で RNA をサンプリングするために、APEX-seq では近接標識アプローチが続きます。特に、分解能の向上にはトランスジェニック材料(アスタリスク)の生成が必要なことが多く、モデル種に対してこれらの方法が主に使用される。TRAPは、細胞壁(CW)やメカニックシグナリング、およびCWマトリックスから放出することが困難な細胞種を含む植物科学研究に特に適しています。B. TRAP手順の詳細なウェットラボステップ:異なる細胞タイプ(例えば根内胚葉)でGFPタグ付きリボソームタンパク質を発現する苗は、7日間ペトリ皿で栽培され、根材料はスナップ凍結によって収穫される。全RNA制御サンプルは、遠心分離によって破片をペレットする前に、均質化された粗抽出物から収集されます。磁性抗GFPビーズをクリアした抽出物に添加して、免疫沈降を行います。インキュベートと3つの洗浄工程の後、ポリソーム関連RNA(TRAP/ポリソームRNA)はフェノール-クロロホルム抽出を介して直接得られます。LCM:レーザーキャプチャマイクロディスセクション、FACS/ファン:蛍光活性化細胞/核選別、 APEX-seq:工学的アスコルビンペルオキシダーゼに基づく方法、INTACT:特定の細胞型にタグ付けされた核の単離、SLAM-ITseq:チオール(SH)結合アルキル化組織中のRNAの代謝シーケンシングに対する、Flura-seq:フルオロシル標識RNAシーケンシング(フルオロシル標識RNAシーケンシング Biorender.com)を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">クリックしてください。</a>
この記事の目的は、TRAP メソッドの詳細な説明を提供し、重要な手順を強調し、可能なライブラリ準備方法のガイダンスを提供することです。
一般的なTRAP実験は、基本的に次のステップで構成されます(図1Bも参照):(1)リボソームタグ構造のクローニング、トランスジェニックラインの生産と選択、種子の成長と増量、ストレス適用/処理(オプション)および組織収穫を含む植物材料の調製。(2)粗抽出物の組織均質化および除去、ビーズ洗浄および免疫精製、および洗浄工程を含む免疫精製;(3) RNA抽出および品質評価(4)図書館の準備。
シロイヌナズナルートは、モデルプラント37,38として導入されて以来、38植物開発を研究するモデルシステムとなっています。ここでは、TRAPの適用は植物側面根開発の文脈で紹介される。植物では、全体の根系の蓄積は、このプログラムの実行に依存し、したがって、生物の生存のために非常に重要である39.シロイヌナズナシスでは、横根はxylem血管の隣に存在するペリサイクル組織に由来し、したがってxylem極ペリサイクル(XPP;図2Cを参照)40と呼ばれます。根の奥深くに位置する一部のXPP細胞は、創始者の細胞の同一性を獲得し、局所ホルモンの引き金に基づいて、反クリン41を腫脹して分裂させることによって増殖し始める。しかし、硬質細胞壁マトリックスの存在により、このプロセスは周囲の組織に機械的なストレスを与えます。特に、上方の内皮は、根根成長軸42、43、44,43,の邪魔であるように影響を受ける。実際、新たに形成されたプリモジウムは、上層の内皮細胞(図2C2)を介して成長する必要がありますが、皮質および表皮細胞は、プリモジウムが最終的に45、46,46を出現させるために脇に押し出されるだけです。私たちの研究室での最近の研究は、内皮が積極的にペリサイクルの増殖に対応するために貢献していることを示しています。内皮ホルモンシグナル伝達の標的遮断は、XPP細胞47における非常に最初の分裂を阻害するのに十分である。したがって、ペリサイクル-子宮内皮通信は、シロイヌナズナの横根開発のための非常に初期のチェックポイントを構成する。しかし、このクロストークがどのように行われるかは分かっていません。この謎を解明するために、XPP細胞と内皮細胞を標的とするTRAP-seqアプローチを選択しました。横根プログラムの細胞を濃縮するために、オーキシンアナログ(1-ナフタレ酢酸、NAA)48を外因的に適用することによってホルモントリガーを模倣し、同時に側根形成の48初期段階を時間的に解決することを可能にした。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

本稿では、リボソーム親和精製(TRAP)法と連続して最適化された低入力ライブラリ調製を通じて、異なるシロイヌナナの根細胞型から翻訳データを取得するための実践的な指示を与える。
原料として、適切なプロモーターを用いることで、細胞型特異的な方法でGFPタグリボソームタンパク質RPL18を発現する植物ラインを採用しています。免疫精製とRNA抽出の前に、組織は凍結され、組織の完全性を維持し、同時に高い時間分解能で時系列研究を実行することができます。特に、細胞壁構造はそのまま残っており、これは、異なる細胞集団を単離するために組織をプロトパロントに依存する蛍光活性化細胞選別ベースのアプローチのような代替手順の大きな欠点である。さらに、レーザー捕捉マイクロ解剖ベースの技術のように組織固定は必要なく、高品質のRNAを得ることができます。
しかし、細胞の亜集団からのサンプリングと、ポリソーム関連RNAの単離のみがRNAの収量を著しく制限します。したがって、RNA-seqによるデータ取得を成功させるためには十分に感受性の高いライブラリ調製方法を適用する必要がある。
TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路を伴うため、植物研究に理想的なツールを提供します。特定の細胞集団を標的とするプロモーターの使用は、臓器と単一細胞レベルの間のギャップを埋めており、その結果、解像度の低下や非常に高いコストに苦しんでいます。ここでは、トラップを適用して、横根形成における細胞細胞通信を研究する。

品質評価のために、上記の手順は、いくつかの中間ステップで調査する必要があります:プランタの発現パターン検証、分離された多ソームRNAの品質管理、および最終ライブラリの品質管理。既知のマーカー遺伝子を用いたqRT-PCRは、加えて、処置条件に対する応答を確認するか、または実験条件を微調整するために行うことができる。
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq などのダウンストリーム解析ツールは、組織および細胞の種類特異的発現プロファイルを明らかにします。

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

TRAPを使用すると、細胞分解能での発達処理を調査することができます。細胞型特異的プロモーターを使用してタグ付きリボソームサブユニットを駆動し、そこからポリソームRNAを分離することができます。このプロトコルは高品質のRNAを生成しますが、非常に限られた量で、したがって、高品質のRNAライブラリを確実に生成するために超低入力に特化した方法が必要です。TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路に依存しているため、植物研究に理想的なツールです。TRAPを用い、横根形成における細胞細胞通信を研究する。良質のRNAを得ることが予想ほど単純ではないことが判明したので、このステップバイステップのビデオ命令がTRAPの適用性を高め、この強力な技術を促進するのに役立つことを願っています。伝播されたホモ接合ラインを殺菌するために、12で12センチメートルの平方ペトリ皿に種子の300マイクロリットル未満を均等に広げ、60リットルの乾燥剤に皿を積み重ねる。一晩のガス滅菌後、種子を50ミリリットルの貯蔵チューブに集める前にガスを蒸発させます。めっきする前に、殺菌した種子を0.1%寒天で希釈し、1皿当たりのインビベッドシードミックスを1ミリリットル得る。シードミックスをプレートするには、正方形のペトリ皿の蓋を使用して、プレートごとに3列の種子を植えるラミネートテンプレートホルダーを作成し、空の寒天プレートをテンプレートホルダーに入れます。3列のプレートに1ミリリットルの種子を均等に分配します。そして、種子が乾燥するまで、層流の積み重ねに加工されたプレートを置きます。種子が寒天の表面にくっついてきたら、蓋を閉め、マイクロポアテープで各プレートを密封します。関心のある薬剤を用いたシロイヌナズナの根の外因性治療のために、1.5〜2センチメートル幅、長さ10センチメートルのティッシュペーパーを調製する。10マイクロモルNAAにティッシュペーパーを浸し、ピンセットを使用して根の各列にティッシュペーパーを塗布します。その後、気泡を軽く押し出し、余分な液体をプレートから空にしてから、プレートに時間でラベルを付けます。適切な実験エンドポイントで、鉗子を使用して根を取り外すことなく各プレートからティッシュペーパーストリップを慎重に取り除き、外科用ブレードを使用してシュートルート接合部に沿って1行につき1回、1回のストロークで切断します。ピンセットを使用して各行のルートに沿ってスワイプし、3つのバンドルでルートを収集します。そして、スナップ凍結のために、液体窒素で満たされた50ミリリットルのチューブに根を空にします。処理ごとにすべての根試料が採取されたら、チューブ蓋を使用して余分な液体窒素をデカントし、根がこぼれるのを防ぎます。そして、80°Cの貯蔵のために、Doer容器にチューブを置きます。組織研削および均質化の場合は、標準的なラボグローブの下に綿手袋を着用し、ポリソーム抽出バッファにPMSFを追加します。液体窒素を含むモルタルに組織サンプルを空にし、冷却された害虫を使用して、すべての材料が白い粉末として現れるまで慎重に組織を粉砕します。すべての組織が粉砕されたら、サンプルにポリソーム抽出バッファーの5ミリリットルを追加し、すぐにバッファーが凍結する前に粉末と凍結組織断片を混合します。混合物が移すことができるとすぐに、氷の上のガラスホモジナイザーにスラリーを空にし、モルタルと害虫をすすぐポリソーム抽出バッファーの追加の2ミリリットルを使用します。抽出物が均質になるまでスラリーを手動で粉砕します。次に、粗根エキスを氷上の50ミリリットル遠心分離管に注ぎ、次のサンプルを実例通りに処理します。RNAの総回収のために、各粗サンプルの200マイクロリットルのアリコートを、個々のクリーンで、事前に冷却された、標識されたマイクロ遠心分離管に移します。細胞壁、破片、大きなオルガネラを除去するには、サンプルを遠心分離し、上澄み物を新鮮で冷却済みの円錐形チューブにデカントして2番目の遠心分離を行います。チューブが回転している間、サンプルあたりの磁気GFPビーズのアリコート60マイクロリットルは、1.5ミリリットルのチューブに。そして、上清除去を容易にするために、磁気スタンドにチューブを置きます。次いで、1回の洗浄液1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、サンプル当たり60マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを再懸濁します。遠心分離の直後に、クリアした上清をラベル付き15ミリリットルチューブにデカントし、各サンプルに60マイクロリットルの洗浄ビーズを加える。次に、すべてのサンプルを氷のバケツに水平に置き、揺れで2時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、氷上の磁気スタンドにビーズを集め、残りのポリソーム抽出バッファーにPMSFを加えます。上清を捨て、サンプルに約5ミリリットルのポリソーム抽出バッファーを加え、サンプル内のビーズを緩やかな傾きで再中断します。サンプルを氷の上のシェーカーで15分間揺らし、続いて磁石に新鮮な洗浄バッファーを入れた2回の洗浄を行います。最後の洗浄後、1ミリリットルの洗浄バッファーでサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。そして、磁気スタンドにビーズをもう一度集めて、上清のすべてを取り除きます。次に、すべてのサンプルが処理されるまでチューブを氷の上に置きます。ラボ用品の再調整については、まず、すべての機器を化学廃棄物にリンスします。乳鉢、害虫、ホモジナイザーを石鹸で手洗いしてから、各器具を十分に洗い流します。次に、装置を熱安全容器に入れ、220°C以上で材料を一晩焼きます。リムとヒュームフード付きのオートクレーブトレイにチューブを置く前に、外気剤ですべての遠心管を洗剤できれいに磨きます。液体ジエチルパイロカーボネート1ミリリットルと脱イオン水溶液1リットルを3〜18時間チューブに注ぎます。次に、オートクレーブ内のチューブのトレイを殺菌する前に溶液を集めます。ここでは、GFP信号を有する代表的な植物を示す。ヨウ化プロピジウムでの逆染色は、細胞壁の輪郭を示す。線は、内皮の局在パターン、およびxylem極ペリサイクルに対応しています。ポリソームRNAから得られたこれらの代表的な測定では、ほとんどのサンプルは分解をほとんど示さなかったが、RNAの完全性の数は9から10までである。これらのグラフでは、正常に準備されたライブラリの痕跡を観察することができ、スケールダウンされた反応量にもかかわらず、手順の堅牢性を強調することができます。ゲノムスパンデータセットが作成される前に、パイロット実験からTRAP RNAを定量的なRTPCRでプローブし、治療の成功および/または実験条件、ならびに組織特異性を検証することができます。この分析では、3つのオーキシン応答性遺伝子の試験は、治療の2時間後に成功したホルモン誘導を確認した。シーケンシングデータから取り出した組織特異的マーカー遺伝子プロファイルは、細胞型特異性を確認した。RNAを扱うときは、良い練習のアドバイスに従ってください。滅菌ベンチで作業し、RNA除去溶液で機器を洗浄し、手袋を着用し、汚染されたらすぐに交換してください。手順中に使用されたすべての有毒化学物質およびガス、特にフェノール-DEPC塩素ガスおよび液体窒素を適切に処理し、廃棄してください。オミック研究のポートフォリオでは、TRAPは重要なニッチを占めており、特に発生生物学において、多くの生物学的質問に答えるためにすでに使用されており、TRAPは大きな可能性を秘めています。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;開発と遺伝子発現

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...