Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 중요한 전문가 조언을 취리히 유전 다양성 센터의 장 클로드 Walser에 감사드립니다. Vermeer 연구소의 작업은 SNF 교수 직교 보조금(PP00P3_157524)과 JEMV에 수여된 스위스 국립 과학 재단(SNSF)의 R'EQUIP 장비 보조금(316030_164086)에 의해 지원되었습니다.

1. 이식 유전자의 복제, 형질전환 라인 생산 및 선택
<ol><li>적절한 엔트리 벡터에서 선택된 프로모터를 복제한다. 재조합 계 클론방법(표 오브 머티리얼)을사용하고 pDONRP1-P249에서재조합 기반 복제를 사용하여 pDONRP4-P1r. 클론 RPL18(선호도 태그 또는 선택의 형광 단백질 포함)에서 프로모터를 재결합한다.</li>
	<li>RPL18을 함유하는 엔트리 벡터를 프로모터-함유 진...

RPL18 현지화 패턴 검증 TRAP 실험에서 데이터의 잘못된 해석을 방지하는 데 중요한 것은 태그가 지정된 리보소말 소단위의 적절한 발현 패턴입니다. 따라서, RPL18에 에피토프 태그로서 GFP의 혼입은 매우 우아하게 동일한 조직에서 다각성 분획의 원하는 발현 패턴 및 연속적으로, 풀다운의 검증을 가능하게 한다. 적절한 프로모터 패턴을 보장하기 위한 보다 침습적인 접근법은 Jiao 및 M...

차세대 염기서열 분석 기술의 응용이 증가함에 따라 개발 생물학의 공간 해상도가 증대될 수 있습니다. 현대 연구는 단세포 수준1,2,2,3,,4가아니라면, 전문화한 세포 모형에 조직을 해부하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해, 지난 50년 동안 다양한 방법이 고안되었다(도 1A참조)5,6,6,77,8,,9,,10,,11,12,,13,,14,,15.,
식물 과학의 많은 도구는 동물 연구에서 개척 된 기술의 적응되었습니다. 여기에서 자세히 소개하는 방법은 그렇지 않습니다. 2005년, 단백질 번역에 대한 탄탄한 배경을 갖춘 베일리-세레스 연구소는 후속 친화도 정제16을위해 리보소말 단백질을 설계하기 시작했습니다. 따라서, 그들은 수크로오스 그라데이션을 가진 초원심분리에 기초하고 1960년대,17,18년이후 리보솜 을 번역하는 데 사용된 시간 소모적이고 노동 집약적인 폴리솜 프로파일링을 피할 수 있었다. 상기 방법은 이후 번역리보솜 친화도 정제(TRAP)16으로지칭되었다. 식물에서 성공적인 트랜스플라토메 연구 후, Heiman 등은 동물19에 대한 TRAP을 적용했으며 다른 동물은 효모20, 초파리21, 제노푸스22 및 제브라피시23,,24로적용을 확대했다.
모델 시스템의 유전자 변형은 TRAP의 전제 조건이지만, 이는 유전자 변형에 대한 적용을 제한하는 종에 대한 적용을 제한하지만, 하나는 동시에 특별한 관심과 그렇지 않으면 손상되지 않은 조직 / 기관(예를 들어, 감염된 식물 에서 마우스 뇌 또는 곰팡이 hyphae에서 고도로 분지 수지상 세포)에서 분리하기 매우 어려운 세포의 하위 세트를 대상으로이 반대를 활용할 수 있습니다. 식물에서, 모든 세포는 정수체골격(26)의기초를 형성하는 세포벽을 통해 제자리에 유지된다. 이 매트릭스에서 식물 세포를 해방하기 위하여는, 과학자는 레이저 포획 미세 분부 (LCM)27를 통해 그 주변 조직에서 세포를 물리적으로 잘라내거나 세포벽28의효소 소화를 수행했습니다. 후자의 세포 들 중, 소위 프로토 플라스타체, 관심있는 집단은 형광 표지되고 형광 활성화 세포 선별(FACS)7을통해 분리될 수 있다. LCM은 일반적으로 그것의 RNA29의질을 궁극적으로 악화시키는 왁스에서 고정되고 매립되는 견본을 요구합니다. FACS 기반 방법은 고품질 RNA를 산출하지만, 프로토라스팅 자체의 과정은 유전자 발현30의 차이를 도입하고 변형되고 두꺼운 이차 세포벽을 가진 조직은 치료하기가 악명 이어 있다. 더욱이, 식물의 많은 발달 공정은 기계적으로 전송된 신호에 의존하는 것으로 가정되므로 세포벽의 무결성이 가장 중요하다31. 핵의 수준에서 작동하여 세포 격리를 우회하기 위해 바로 가기를 사용하는 두 가지 방법은 형광 활성화 핵 선별 (FANS) 및 특정 세포 유형 (INTACT)에 태그 된 핵의 분리입니다. TRAP에서와 같이, 그(것)들은 핵을 표시하기 위하여 세포 유형 특정 프로모터를 이용하고, 그 후에 분류를 통해 농축되거나, 각각8,,15. 이 모든 접근을 위한 중요한 도전은 조직에 있는 세포의 부분 집합에서 충분한 RNA 물자를 얻는 것입니다. TRAP이 셀룰러 RNA의 일부만 캡처하므로 샘플 수집은 상당한 병목 현상입니다. 따라서 낮은 입력 량에서 고품질 데이터를 생성하려면 특히 중요한 라이브러리 준비 프로토콜이 필요합니다.
설립 이래, TRAP은 DNA 마이크로어레이와 병용되어 사용되거나, 시퀀싱 비용이 최근 몇 년 동안 현저히 감소함에 따라, RNA-seq10,,32,,33. 연구 질문의 무리는 이미 사블락 등에서 검토로 해명되었습니다34. 우리는 기술이 특정 세포 모형을 표적으로 하기 위하여 다른 프로모터를 결합할 때 아주 다재다능하기 때문에 앞으로 더 많은 보고가 따를 것이라는 점을 확신합니다. 결국, 이것은 유도 할 수있는 방법으로도 수행 될 것이며, 많은 생물학적 및 비생물적 스트레스 요인에 대한 식물의 반응을 조사하는 것으로 결합 될 수 있습니다. 또한, 안정적인 형질전환라인을 사용할 수 없는 곳에서는, 털이 많은 뿌리 발현 시스템도 토마토와메디아고(35,,36)에서TRAP을 수행하는 데 성공적으로 사용되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> 그림 1: 리보솜 친화성 정제(TRAP)를 번역하는 것은 "오믹스" 분석 포트폴리오를 보완합니다. A. 분석 정밀도의 증가 수준, 단일 세포 또는 심지어 세포 이하 의 해상도는 이들의 방법 또는 조합의 과다에 의해 달성 될 수있다. 이 계획은 식물과 동물 분야에서 현재 사용 가능한 도구의 개요를 제공합니다. 세포 결정에서 조직 수집은 LCM 또는 FACS와 같은 프로토콜에 의해 달성 될 수 있으며, 표준 전사체 또는 폴리섬 프로파일링 / 트랜스 라토메 분석과 결합됩니다. TRAP 과 INTACT는 에피토프 태깅을 기반으로 조직 캡처 및 RNA 격리를 모두 통합합니다. 그러나, INTACT 는 세포 핵만을 샘플링하고, 따라서, 전사체 분석의 특별한 경우를 구성한다. 작은 토끼 아이콘은 동물 분야에서 새로 개발 된 방법을 표시 : SLAM-ITseq 및 Flura-seq는 허용 효소를 발현하는 세포에서 수정 된 우라실 염기를 가진 초기 RNAs의 대사 지색에 의존하는 반면, Slide-seq는 세포 범위에서 위치 정보를 제공하는 DNA 바코드가있는 코팅 된 유리 슬라이드를 사용합니다. 근접 라벨링 접근법은 APEX-seq에서 특정 세포 외 구획에서 RNA를 샘플링하는 방법을 따릅니다. 특히, 증가 된 해상도는 종종 형질전환 물질 (별표)의 생성을 필요로하고 이러한 방법은 따라서 주로 모델 종에 사용된다. TRAP은 특히 CW 매트릭스에서 방출하기 어려운 세포종뿐만 아니라 세포벽(CW) 또는 역학 신호와 관련된 식물 과학 연구에 적합합니다. B. TRAP 절차의 상세한 습식 실험실 단계: GFP 태그가 달린 리보좀 단백질을 구별된 세포 유형(예: 뿌리 내피)에서 발현하는 모종은 7일 동안 페트리 접시에서 재배되고 스냅 동결에 의해 수확된 뿌리 재료입니다. 총 RNA 제어 샘플은 원심 분리를 통해 파편을 펠릿하기 전에 균질화된 원유 추출물로부터 수집됩니다. 자기 항-GFP 비드는 면역 침전을 수행하기 위해 클리어된 추출물에 첨가된다. 배양 및 3개의 세척 단계 후, 폴리솜 관련 RNA(TRAP/폴리솜 RNA)는 페놀-클로로포름 추출을 통해 직접 수득된다. LCM : 레이저 캡처 미세 해부, FACS / 팬 : 형광 활성화 세포 / 핵 선별, APEX-seq: 엔지니어링 된 아스코르브 인 과산화제에 기초한 방법, INTACT: 특정 세포 유형에 태그 된 핵의 격리, SLAM-ITseq: THIOL(SH)-조직내 RNA의 대사 시퀀싱에 대한 연결 알킬레이션, 플루라-세크: 플루라-세크: 플루라-세크: 플루오라실 라벨RNA 시퀀싱(Biorender.com 이쪽을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">클릭하십시오.</a>
이 문서의 목표는 TRAP 메서드에 대한 자세한 설명을 제공하고 중요한 단계를 강조 표시하고 가능한 라이브러리 준비 방법에 대한 지침을 제공하는 것입니다.
일반 TRAP 실험은 본질적으로 다음 단계로 구성됩니다 (도 1B참조) ( (1) 리보솜 태깅 구조의 복제, 형질 전환 라인 생산 및 선택, 씨앗의 성장 및 벌킹, 살균 및 도금, 스트레스 적용 / 치료 (선택 사항) 및 조직 수확을 포함한 식물 재료의 준비; (2) 조 추출물의 조직 균질화 및 개간, 비드 세척 및 면역정화, 및 세척 단계를 포함하는 면역화; (3) RNA 추출 및 품질 평가; (4) 도서관 준비.
애기장대 뿌리는 모델 플랜트37,,38으로도입된 이래 식물 개발을 연구하는 모델 시스템이다. 여기서 TRAP의 적용은 식물 측면 루트 개발의 맥락에서 전시된다. 식물에서 전체 루트 시스템의 축적은이 프로그램의 실행에 의존하므로 유기체(39)의생존에 매우 중요합니다. 애기장대에서,측면 뿌리는 자일렘 혈관 옆에 상주하는 pericycle 조직에서 유래하고 따라서 자일렘 극 페리사이클이라고합니다 (XPP; 그림 2C참조)40. 뿌리 안쪽 깊숙이 위치한 일부 XPP 세포는 설립자 세포 정체성을 얻고 국소 호르몬 트리거에 따라 팽창과 반대로41을나누어 증식하기 시작합니다. 그러나 단단한 세포벽 매트릭스가 존재하기 때문에이 과정은 주변 조직에 기계적 응력을 가합니다. 특히, 횡근근성장축(42,,43,,4244)의방식이기 때문에, 과도내피증이 영향을 받는다. 실제로, 새로 형성된 프리모르듐은 지나치게 내피세포(도2C2)를통해 성장해야 하는 반면 피질과 표피 세포는 프리모르듐이 마침내45,,46으로나타난다. 우리의 실험실에 있는 최근 일은 내분비가 pericycle에 있는 확산을 수용하기 위하여 적극적으로 기여하고 있다는 것을 보여주었습니다. 내피 호르몬 신호의 표적 차단은 XPP세포(47)에서의제1 분열조차도 억제하기에 충분하다. 따라서, pericycle-endodermis 통신은 애기장대에서측근 발달을 위한 아주 초기 체크포인트를 구성합니다. 그러나 이 크로스토크가 어떻게 수행되는지는 알 수 없습니다. 이 수수께끼를 풀기 위해 XPP 및 내피 세포를 대상으로 하는 TRAP-seq 접근법을 선택했습니다. 측면 루트 프로그램에서 세포를 풍부하게하기 위해, 우리는 외인성으로 auxin 아날로그를 적용하여 호르몬 트리거를 모방 (1-naphthaleneacetic 산, NAA)48,이는 동시에 일시적으로 측면 루트 형성의 초기 단계를 해결 허용.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

이 기사에서는 번역 리보솜 친화도 정제 (TRAP) 방법 및 연속최적화 된 낮은 입력 라이브러리 준비를 통해 상이한 애기장대 탈리아나 루트 세포 유형에서 translatome 데이터를 얻기 위한 실습 지침을 제공합니다.
시작 재료로서, 우리는 적절한 프로모터를 사용하여 세포 유형별 방식으로 GFP 태그리보소말 단백질 RPL18을 발현하는 식물 라인을 사용합니다. 면역 정화 및 RNA 추출 전에 조직은 고정되어 조직 무결성을 보존하고 동시에 높은 시간적 해상도로 타임 시리즈 연구를 실행할 수 있습니다. 특히, 세포벽 구조는 손상되지 않은 상태로 남아 있으며, 이는 뚜렷한 세포 집단을 분리하기 위해 조직 에 의존하는 형광 활성화 세포 선별 기반 접근법과 같은 대체 절차의 주요 단점입니다. 또한 고품질 RNA를 얻을 수 있는 레이저 포획 미세 해부 기반 기술에서와 같이 조직 고정이 필요하지 않습니다.
그러나, 세포의 하위 집단에서 샘플링만 폴리섬 관련 RNA를 격리하는 것은 RNA 수율을 심각하게 제한합니다. 따라서 RNA-seq에 의한 성공적인 데이터 수집을 위해 충분히 민감한 라이브러리 준비 방법을 적용해야 합니다.
TRAP은 세포벽 관련 및 기계적 신호 경로와 관련된 많은 개발 공정으로 플랜트 연구에 이상적인 도구를 제공합니다. 특정 세포 집단을 표적으로 하는 프로모터의 사용은 차례차례로 작은 해결책 또는 아주 높은 비용 때문에 손해를 입는 기관과 단세포 수준 사이 격차를 다리로 입니다. 여기에서, 우리는 측방 루트 형성에 있는 세포 세포 통신을 공부하기 위하여 TRAP를 적용합니다.

품질 평가를 위해, 전술한 절차는 몇 가지 중간 단계에서 조사되어야 한다: 질라에서의 발현 패턴 검증, 단리된 다각형 RNA의 품질 관리뿐만 아니라 최종 라이브러리. 공지된 마커 유전자를 이용한 qRT-PCR은, 또한, 치료 조건에 대한 반응을 확인하거나 실험 조건을 미세 조정하기 위해 수행될 수 있다.
GFP 신호 분포의 공초?...

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Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

TRAP을 사용하면 셀룰러 해상도에서 개발 처리를 조사할 수 있습니다. 당사는 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 태그된 리보솜 하위 단위를 구동하고, 거기에서 우리는 다성 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고품질 RNA를 산출하지만 매우 제한된 수량으로 고품질 RNA 라이브러리를 안정적으로 생산하기 위해서는 초저 입력을 전문으로 하는 방법이 필요합니다.TRAP은 많은 발달 과정이 세포 벽 관련 및 기계적 신호 경로에 의존하기 때문에 식물 연구에 이상적인 도구입니다. 우리는 말기 뿌리 형성에서 세포 세포 통신을 연구하기 위해 TRAP을 사용합니다. 좋은 품질의 RNA를 얻는 것이 우리가 예상했던 것처럼 똑바로 앞으로 증명으로, 우리는이 단계별 비디오 교육이 TRAP 적용성을 증가하고이 강력한 기술을 촉진하는 데 도움이 되기를 바랍니다.전파된 호모지구스 라인을 살균하기 위해 12-12센티미터 제곱 페트리 접시에 300 마이크로리터 미만의 씨앗을 고르게 펴고 60리터 데시케이터에 접시를 쌓아 놓습니다. 하룻밤 동안 가스 살균 후, 50 밀리리터 저장 튜브로 씨앗을 수집하기 전에 가스가 증발하자. 도금 하기 전에, 멸균 된 씨앗을 0.1%의 천으로 희석하여 플레이트 당 1 밀리리터의 씨앗 믹스를 얻습니다.씨앗 믹스를 접시에 담아, 사각형 페트리 접시 뚜껑을 사용하여 접시 당 세 줄의 씨앗을 심기위한 적층 템플릿 홀더를 만들고 빈 한천 판을 템플릿 홀더에 놓습니다. 3열의 접시에 고균하게 임비드 씨앗1밀리리터를 분배합니다. 그리고 가공 된 플레이트를 라미나르 흐름에 쌓아 놓고 씨앗이 건조 할 때까지 놓습니다.씨앗이 한천 표면에 붙어있을 때 뚜껑을 닫고 각 접시에 마이크로 포어 테이프로 밀봉하십시오. 관심있는 에이전트를 가진 아라비도시스 뿌리의 외인성 처리를 위해, 조직 종이의 1.5 에서 2 센티미터 너비, 10 센티미터 길이, 스트립을 준비하십시오. 10 마이크로 몰라 NAA에 티슈 페이퍼를 담그고 핀셋을 사용하여 각 뿌리 줄에 티슈 페이퍼 스트립을 적용하십시오.그런 다음, 거품을 부드럽게 누르고 접시에서 여분의 액체를 비우고 접시에 라벨을 붙입니다. 적절한 실험 종점에서는 포셉을 사용하여 뿌리를 분리하지 않고 각 플레이트에서 티슈 페이퍼 스트립을 조심스럽게 제거하고 수술용 블레이드를 사용하여 촬영 루트 접합을 따라 행당 한 번 절단하여 단일 결정된 스트로크로 절단합니다. 핀셋을 사용하여 각 행의 뿌리를 따라 스 와이프하여 세 번들로 뿌리를 수집합니다.그리고 액체 질소로 채워진 50 밀리리터 튜브에 뿌리를 비우고, 스냅 동결을 위해. 치료당 모든 루트 샘플을 채취하면, 튜브 뚜껑을 사용하여 과도한 액체 질소를 데산하여 뿌리가 유출되는 것을 방지한다. 그리고 80섭씨 저장을 위해 튜브를 도어 용기에 넣습니다.조직 연삭 및 균질화를 위해 표준 실험실 장갑 아래에 면 장갑을 착용하고 다각성 추출 버퍼에 PMSF를 추가하십시오. 액체 질소를 포함하는 박격포에 조직 샘플을 비우고, 모든 물질이 백색 분말로 나타날 때까지 조심스럽게 조직을 분쇄하기 위해 냉각 된 유봉을 사용합니다. 모든 조직이 분쇄되면, 샘플에 폴리좀 추출 버퍼의 5 밀리리터를 추가하고 버퍼가 정지하기 전에 분말과 냉동 조직 조각을 신속하게 혼합합니다.혼합물을 옮길 수 있는 즉시 슬러리를 얼음 의 유리 균질화제로 비우고 폴리오톤 추출 버퍼의 2밀리리터를 추가하여 박격포와 유봉을 헹구는다. 추출물이 균일할 때까지 슬러리를 수동으로 갈아. 그런 다음, 얼음에 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 조루 뿌리 추출물을 붓고, 입증된 대로 다음 샘플을 처리한다.총 RNA 수집을 위해 각 원유 샘플의 200 마이크로리터 알리쿼트를 개별 깨끗하고 미리 냉각된 마이크로센심분리기 튜브로 이송합니다. 세포벽, 파편 및 대형 세포기관을 제거하려면 샘플을 원심분리하고 두 번째 원심분리를 위해 미리 냉각된 신선한 원뿔 튜브로 상류관을 제거합니다. 튜브가 회전하는 동안, 시료 당 자기 GFP 구슬의 60 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다.그리고 상체 제거를 용이하게하기 위해, 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 이어서, 워시당 냉세척 버퍼 1밀리리터로 구슬을 2회 세척하고, 시료당 60마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 다시 정지시한다. 원심 분리 직후, 클리어된 상체를 15밀리리터 튜브로 장식하고 각 샘플에 60 마이크로리터의 세척구를 추가합니다.그런 다음 모든 샘플을 얼음 양동이에 수평으로 넣고 흔들어 두 시간 동안 잠식합니다. 인큐베이션이 끝나면 얼음 위에 있는 자기 스탠드에 구슬을 수집하고 나머지 다편 추출 버퍼에 PMSF를 추가합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, 샘플에 약 5밀리리터의 다일부 추출 버퍼를 추가하고 부드러운 기울기로 샘플 내에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.얼음에 셰이커에 15 분 동안 샘플을 바위, 다음 자석에 신선한 세척 버퍼와 두 세척, 입증 된 바와 같이. 마지막 세척 후, 세척 버퍼의 1 밀리리터에 샘플을 전송, 1.5 밀리리터 튜브로. 그리고 모든 상체를 제거하기 위해 자기 스탠드에서 구슬을 한 번 더 수집합니다.그런 다음 모든 샘플이 처리될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 실험실 소모품의 재조정을 위해 먼저 모든 장비를 화학 폐기물로 헹구는 것입니다. 각 기기를 완전히 헹구기 전에 박격포, 유봉 및 균질화제를 비누로 손 씻으십시오.다음으로 장비를 열에 안전한 용기에 넣고 밤새 220도 이상의 고리에서 재료를 굽습니다. 모든 원심분리기 튜브를 세제로 깨끗하게 닦은 후, 튜브를 림과 연기 후드가 있는 자동 복제 가능한 트레이에 놓습니다. 액체 다이틸 파이로카보네이트 1밀리리터와 1리터의 탈이온화된 용액을 튜브에 3~18시간 동안 붓습니다.그런 다음 오토클레이브에서 튜브 트레이를 살균하기 전에 용액을 수집합니다. 여기서, GFP 신호가 있는 대표적인 식물이 표시됩니다. 프로피듐 요오드로 염색하는 것은 세포벽 윤곽을 표시합니다.선은 내도피의 국소화 패턴및 자일렘 극 pericycle에 해당합니다. 다각성 RNA에서 얻은 이 대표적인 측정에서, 대부분의 견본은 9에서 10에 구역 수색하는 RNA 무결성 수와 아주 작은 저하를 보여주었습니다. 이러한 그래프에서는 성공적으로 준비된 라이브러리의 흔적을 관찰하여 축소된 반응 볼륨에도 불구하고 절차의 견고성을 강조할 수 있습니다.게놈 에걸레를 배합한 데이터 세트가 생성되기 전에, 파일럿 실험에서 TRAP RNA는 정량적 RTPCR에 의해 조사되어 치료 성공 및/또는 실험 조건뿐만 아니라 조직 특이성을 검증할 수 있다. 이 분석에서, 3개의 auxin 반응성 유전자의 시험은 처리의 2 시간 후에 성공적인 호르몬 유도를 확인했습니다. 시퀀싱 데이터로부터 회수된 조직 특이적 마커 유전자 프로파일은 세포 형 특이성을 확인하였다.RNA를 다룰 때 좋은 연습 조언을 따르십시오. 멸균 벤치에서 일하고 RNA 제거 용액으로 장비를 청소하고 장갑을 착용하고 오염되면 즉시 교체하십시오. 특히 페놀-DEPC 염소 가스 및 액체 질소, 절차 중에 사용 되 었던 모든 독성 화학 물질 및 가스를 적절히 처리하고 폐기하십시오.omic 연구의 포트폴리오에서 TRAP은 중요한 틈새 시장을 차지하고 있으며, 이미 많은 생물학적 질문에 대답하는 데 사용되어 왔으며, 특히 발달 생물학에서 TRAP은 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

자기장 (GMF)과 식물 진화 : GMF 반전의 효과에 대한 조사<em&gt; 애기 장대</em&gt; 개발 및 유전자 발현

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

연구

발생학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...