Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Jean-Claude Walser fra Genetic Diversity Center Zurich for avgjørende ekspertråd i den tidlige fasen av dette prosjektet. Arbeidet i Vermeer-laboratoriet ble støttet av et SNF Professorship-stipend (PP00P3_157524) og et R'EQUIP-utstyrsstipend (316030_164086) fra Swiss National Science Foundation (SNSF) tildelt JEMV.

1. Kloning av transgene, transgen linjeproduksjon og valg
<ol><li>Klone arrangøren av valget i riktig oppføring vektor. Bruk en rekombinasjonsbasert kloningsmetode (Materialtabellen) og kombiner arrangørene på nytt i pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (med affinitetsmerke eller fluorescerende protein) ved hjelp av rekombinasjonsbasert kloning i pDONRP1-P249.</li>
	<li>Kombiner inngangsvektoren som inneholder RPL18 med den promoterholdige inngangsvektoren i en tofragments reko...

Verifisering av RPL18 lokaliseringsmønster Avgjørende for å unngå feiltolkning av data fra et TRAP-eksperiment er riktig uttrykksmønster for den kodede ribosomale underenheten. Derfor tillater inkorporering av GFP som en epitoptag til RPL18 svært elegant verifisering av ønsket uttrykksmønster og fortløpende, nedtrekking av polysome fraksjonen fra samme vev. Mer invasive tilnærminger for å sikre riktig promotor mønstre etterfølges av Jiao og Mayerowitz 2010, som krever GUS-farging og i Tia...

Drevet av den økende anvendelsen av neste generasjons sekvenseringsteknikker, kan romlig oppløsning i utviklingsbiologi økes. Moderne studier tar sikte på å dissekere vev ned til spesialiserte celletyper, om ikke encellede nivå1,2,3,4. For dette formål har en mengde forskjellige metoder blitt utarbeidet i løpet av de siste femti årene (se figur 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mange verktøy i plantevitenskap har vært tilpasninger av teknikker som var pionerer i dyreforskning. Dette er ikke tilfelle for metoden vi introduserer i detalj her. I 2005, utstyrt med sterk bakgrunn i proteinoversettelse, satte Bailey-Serres Lab ut for å konstruere ribosomale proteiner for påfølgende affinitetsrensing16. Dermed kunne de unngå tidkrevende og arbeidskrevende polysom profilering, som er basert på ultracentrifugering med en sukrosegradient og ble brukt til å vurdere å oversette ribosomer siden 1960-tallet17,18. Metoden har siden blitt referert til som translasjonell ribosom affinitet rensing (TRAP)16. Etter vellykkede translatome studier i planter, Heiman et al. tilpasset TRAP for dyr19 og andre utvidet sin søknad til gjær20, Drosophila21, Xenopus22 og sebrafisk23,24.
Selv om genetisk modifisering av modellsystemet er en forutsetning for TRAP, som begrenser anvendelsen til arter som er egnet til genetisk transformasjon, kan man samtidig utnytte denne innvendingen mot undergrupper av celler som er av spesiell interesse og ellers ekstremt vanskelig å isolere fra det intakte vevet/orgelet25 (f.eks. svært forgrenede dendrittiske celler i en mushjerne eller sopphyphae i infisert plantevev). I planter holdes alle celler på plass via cellevegger som danner grunnlaget for det hydrostatiske skjelettet26. For å frigjøre en plantecelle fra denne matrisen, har forskere enten fysisk kuttet cellen ut av sitt omkringliggende vev gjennom laserfangstmikrodisseksjon (LCM)27 eller utført enzymatisk fordøyelse av celleveggene28. Blant de sistnevnte cellene, såkalte protoplasts, er befolkningen av interesse fluorescerende merket og kan skilles via fluorescensaktivert cellesortering (FACS)7. LCM krever vanligvis en prøve som skal festes og bygges inn i voks, noe som til slutt forverrer kvaliteten på RNA29. FACS-baserte metoder gir høy kvalitet RNA, men prosessen med å protopelastere i seg selv introduserer forskjeller i genuttrykk30 og vev med modifiserte og tykke sekundære cellevegger er notorisk vanskelig å behandle. Videre antas mange utviklingsprosesser i planter å stole på mekanisk overførte signaler, og derfor er integriteten til celleveggen av avgjørende betydning31. To metoder, som bruker en snarvei til å omgå celleisolasjon ved å operere på nivået av kjerner, er fluorescensaktivert kjernefysisk sortering (FANS) og isolering av kjerner merket i bestemte celletyper (INTAKT). Som i TRAP bruker de celletypespesifikke arrangører for å markere kjerner, som senere blir beriket via sortering eller pull down, henholdsvis8,15. En stor utfordring for alle disse tilnærmingene er å få tilstrekkelig RNA-materiale fra undergrupper av celler i et vev. Som TRAP fanger bare en brøkdel av cellulære RNAs, prøvesamling er en betydelig flaskehals. Spesielt sensitive bibliotekforberedelsesprotokoller er derfor nødvendig for å produsere data av høy kvalitet fra lave inngangsbeløp.
Siden etableringen har TRAP enten blitt brukt i kombinasjon med DNA-mikroarrayer eller, som sekvenseringskostnader falt betydelig de siste årene, RNA-seq10,32,33. En rekke forskningsspørsmål har allerede blitt belyst som gjennomgått i Sablok et al.34. Vi er overbevist om at flere rapporter vil følge i de kommende årene som teknikken er svært allsidig når du kombinerer ulike arrangører for å målrette bestemte celletyper. Til slutt vil dette bli gjort selv på en utilbørlig måte, og kan kombineres med å undersøke anleggets reaksjon på mange biotiske og abiotiske stressfaktorer. I tillegg, der stabile transgene linjer ikke er tilgjengelige, har hårete rotuttrykkssystemer også blitt brukt til å utføre TRAP i tomat og medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figur 1: Translating ribosome affinity purification (TRAP) utfyller "omics" analyseporteføljen. A. Økende nivåer av analytisk presisjon, ned til encellede eller til og med subcellulær oppløsning kan oppnås ved en mengde metoder eller kombinasjoner av disse. Ordningen gir en oversikt over tilgjengelige verktøy i plante- og dyrefeltet. Vevsinnsamling ved cellulær oppløsning kan oppnås ved protokoller som LCM eller FACS, som deretter kobles til standard transkripsjon eller polysome profilering / translatome analyse. TRAP og INTAKT integrerer både vevsfangst og RNA-isolasjon som de er basert på epitop-tagging. Intakte prøver bare cellekjerner og utgjør derfor et spesielt tilfelle av transkripsjonsanalyse. Et lite kaninikon markerer nyutviklede metoder i dyrefeltet: Mens SLAM-ITseq og Flura-seq er avhengige av metabolsk targetting av nascent RNAs med modifiserte uracilbaser i celler som uttrykker det tillatte enzymet, bruker Slide-seq et belagt glasslysbilde med DNA-strekkoder som gir posisjonsinformasjon i cellulærområdet. En nærhetsmerkingstilnærming følges i APEX-seq for å prøve RNAer i bestemte undercellulære rom. Spesielt krever økt oppløsning ofte generering av transgen materiale (stjerner) og disse metodene brukes dermed hovedsakelig til modellarter. TRAP er spesielt egnet for plantevitenskapsstudier som involverer cellevegg (CW) eller mekanikersignalering samt cellearter som er vanskelige å frigjøre fra cw-matrisen. B. Detaljerte våtlabtrinn i TRAP-prosedyren: Frøplanter som uttrykker GFP-merket ribosomalt protein i forskjellige celletyper (f.eks. rotendodermis) dyrkes på Petri-retter i syv dager og rotmateriale høstet ved snap frysing. En total RNA-kontrollprøve samles inn fra det homogeniserte råoljeekstraktet før ruskene blir avstøtende via sentrifugering. Magnetiske anti-GFP perler legges til det klarerte ekstraktet for å utføre immunnedbør. Etter inkubasjon og tre vasketrinn oppnås polysomassosiert RNA (TRAP/polysome RNA) direkte via fenol-kloroformekstraksjon. LCM: laser fangst mikrodisseksjon, FACS / FANS: fluorescens-aktivert celle / kjernefysisk sortering, APEX-seq: metode basert på konstruert ascorbat peroksidans, INTAKT: isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper, SLAM-ITseq: tiol (SH)-koblet alkylation for metabolsk sekvensering av RNA i vev, Flura-seq: fluorouracil-merket RNA sekvensering (Opprettet med Biorender.com) Vennligst klikk her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">å se en større versjon av denne figuren.</a>
Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av TRAP-metoden, for å markere kritiske trinn og gi veiledning for en mulig bibliotekklargjøringsmetode.
Et generisk TRAP-eksperiment vil i hovedsak bestå av følgende trinn (se også figur 1B): (1) Tilberedning av plantemateriale, inkludert kloning av ribosom-tagging konstruksjon, transgen linjeproduksjon og valg, voksende og bulking opp av frø, sterilisering og plating, og stress søknad / behandling (valgfritt) og vev høsting; (2) immunrensing inkludert vevhomogenisering og rydding av råekstrakt, perlevask og immunrensing, og vasketrinn; (3) RNA-ekstraksjon og kvalitetsvurdering; og (4) bibliotekforberedelse.
Arabidopsis roten har vært et modellsystem for å studere planteutvikling helt siden introduksjonen som modellanlegg37,38. Her vises anvendelsen av TRAP i sammenheng med plantesiderotutvikling. I planter er oppbyggingen av hele rotsystemet avhengig av utførelsen av dette programmet og er derfor svært viktig for organismens overlevelse39. I Arabidopsisstammer laterale røtter fra pericycle vev som ligger ved siden av xylem fartøy og derfor kalles xylem pole pericycle (XPP; se figur 2C)40. Noen XPP-celler, som ligger dypt inne i roten, får en grunnleggercelleidentitet og, på en lokal hormonell utløser, begynner å spre seg ved hevelse og dele anticlinally41. Men på grunn av tilstedeværelsen av en stiv celleveggmatrise, utøver denne prosessen mekanisk stress på det omkringliggende vevet. Spesielt påvirkes den overliggende endodermis, da den er i veien for den laterale rotvekstaksen42,43,44. Faktisk må det nylig dannede primordium vokse gjennom den overliggende endodermiscellen (Figur 2C2) mens cortex- og epidermis-celler bare skyves til side for primordium å endelig dukke opp45,46. Nylig arbeid i laboratoriet vårt har vist at endodermis aktivt bidrar til å imøtekomme spredningen i perisyklusen. Målrettet blokkering av endodermal hormonell signalisering er tilstrekkelig til å hemme selv den aller første divisjonen i XPP-cellene47. Derfor utgjør pericycle-endodermis kommunikasjon et svært tidlig kontrollpunkt for lateral rotutvikling i arabidopsis. Det er imidlertid ikke kjent hvordan denne crosstalk utføres. For å løse dette mysteriet valgte vi TRAP-seq-tilnærmingen for å målrette XPP og endodermale celler. For å berike for celler i siderotprogrammet, etterlignet vi den hormonelle utløseren ved å eksogene bruke en auxin analog (1-naftaleneddiksyre, NAA)48, som samtidig lov til å midlertidig løse den første fasen av lateral rotdannelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

I denne artikkelen gir vi praktiske instruksjoner for å få translatome data fra forskjellige Arabidopsis thaliana rotcelletyper via den oversette ribosome affinitetsrensing (TRAP) metoden og påfølgende optimalisert lav-input bibliotek forberedelse.
Som startmateriale bruker vi plantelinjer som uttrykker GFP-merket ribosomalt protein RPL18 på en celletypespesifikk måte ved bruk av tilstrekkelige arrangører. Før immunrensing og RNA-ekstraksjon blir vevet frosset, noe som bevarer vevsintegritet og samtidig tillater gjennomføring av tidsseriestudier med høy temporal oppløsning. Spesielt forblir celleveggstrukturer intakte, noe som er en stor ulempe i alternative prosedyrer som fluorescensaktiverte cellesorteringsbaserte tilnærminger som er avhengige av vevsomforsynt for å isolere forskjellige cellepopulasjoner. I tillegg er ingen vevfiksering nødvendig som i laserfangst mikrodisseksjonsbaserte teknikker, noe som gjør at høykvalitets RNA kan oppnås.
Prøvetaking fra underpopulasjoner av celler og bare isolere polysom-assosiert RNA begrenser rna-utbytter alvorlig. Det er derfor nødvendig å anvende tilstrekkelig sensitive bibliotekforberedelsesmetoder for vellykket datainnhenting av RNA-seq.
TRAP tilbyr et ideelt verktøy for planteforskning, da mange utviklingsprosesser involverer celleveggrelaterte og mekaniske signalveier. Bruken av arrangører for å målrette spesifikke cellepopulasjoner er å bygge bro mellom organ- og encellenivå som igjen lider av liten oppløsning eller svært høye kostnader. Her bruker vi TRAP for å studere cellecellekommunikasjon i lateral rotdannelse.

For kvalitetsvurdering bør den ovennevnte prosedyren undersøkes ved flere mellomliggende trinn: validering av uttrykksmønster i planta, kvalitetskontroll av den isolerte polysomale RNA samt av de endelige bibliotekene. qRT-PCR ved hjelp av kjente markørgener kan i tillegg utføres for å bekrefte responsen på behandlingstilstanden eller for å finjustere de eksperimentelle forholdene.
Konfokal analyse av GFP-signalf...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Oversette ribosome affinitet rensing (TRAP) gir mulighet til å dissekere utviklingsprogrammer med minimal behandling av organer og vev. Protokollen gir høy kvalitet RNA fra celler målrettet med en grønn fluorescerende protein (GFP)-merket ribosomal subunit. Nedstrøms analyseverktøy, for eksempel qRT-PCR eller RNA-seq, avslører vevs- og celletypespesifikke uttrykksprofiler.

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for å undersøke Arabidopsis thaliana Root Development på en celle type-spesifikk skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Med TRAP kan vi undersøke utviklingsbehandling ved mobiloppløsning. Vi bruker celle-type-spesifikke arrangører til å kjøre en merket ribosomal underenhet, og derfra kan vi isolere polysom RNA. Denne protokollen gir RNA av høy kvalitet, men i svært begrensede mengder er derfor metoder som er spesialisert for ultra-lav input nødvendig for å pålitelig produsere RNA-biblioteker av høy kvalitet.TRAP er et ideelt verktøy for planteforskning, fordi mange utviklingsprosesser er avhengige av celleveggrelaterte og mekaniske signalveier. Vi bruker TRAP til å studere cellecellekommunikasjon i lateral rotdannelse. Som å skaffe god kvalitet RNA viste seg ikke så rett frem som vi forventet, håper vi at denne trinnvise videoinstruksjonen vil øke TRAP-anvendeligheten og bidra til å fremme denne kraftige teknikken.For å sterilisere de forplantede homozygøse linjene, spre mindre enn 300 mikroliter frø jevnt på 12 med 12 centimeter kvadrert Petri retter, og stable retter på en 60 liters desiccator. Etter gasssterilisering over natten, la gassen fordampe før du samler frøene i et 50 milliliter lagringsrør. Før plating, fortynne de steriliserte frøene med 0,1% agar for å oppnå en milliliter imbibed frø blanding per plate.For å plate frøblandingen, bruk firkantede petriskållokk for å lage en laminert malholder for planting av tre rader frø per tallerken, og legg tomme agarplater i malholderen. Fordel en milliliter av de imbibed frø jevnt på tre rader med plater. Og legg de bearbeidede platene i stabler i en laminær strøm, til frøene er tørre.Når frøene har festet seg til agarens overflate, lukk lokkene og forsegle hver plate med mikroporetape. For eksogen behandling av Arabidopsis røtter med et middel av interesse, forberede 1,5 til to centimeter bred, 10 centimeter lang, strimler av silkepapir. Bløtlegg vevspapiret i 10 mikromolar NAA, og bruk pinsett til å påføre en stripe med silkepapir på hver rad med røtter.Trykk deretter forsiktig ut eventuelle luftbobler, og tøm overflødig væske fra platen, før du merker platen med tiden. Ved riktig eksperimentelt sluttpunkt, bruk tang til å forsiktig fjerne vevspapirstrimlene fra hver plate uten å løsne røttene, og bruk et kirurgisk blad til å kutte en gang per rad langs shoot-root-krysset, i et enkelt bestemt slag. Bruk pinsett til å sveipe langs røttene til hver rad, for å samle røttene i tre bunter.Og tøm røttene i et 50 milliliter rør fylt med flytende nitrogen, for snap frysing. Når alle rotprøvene per behandling er samlet inn, dekanterer du overflødig flytende nitrogen ved hjelp av rørlokket for å hindre at røttene søler. Og plasser røret i et doerfartøy, for en 80 grader celsius lagring.For vevssliping og homogenisering, bruk bomullshansker under standard laboratoriehansker, og legg PMSF til polysome ekstraksjonsbufferen. Tøm vevsprøven i en mørtel som inneholder flytende nitrogen, og bruk en avkjølt pestle for å forsiktig male vevet til alt materialet vises som et hvitt pulver. Når alt vevet er malt, tilsett fem milliliter polysom ekstraksjonsbuffer til prøven, og bland raskt de frosne vevfragmentene med pulveret før bufferen fryser.Så snart blandingen kan overføres, tøm slammet i en glasshomogenisator på is, og bruk ytterligere to milliliter polysom ekstraksjonsbuffer for å skylle mørtelen og pestle. Slip slurryen manuelt til ekstraktet er homogent. Hell deretter det rå rotekstraktet i et 50 milliliter sentrifugerør på is, og behandle neste prøve som demonstrert.For total RNA-innsamling, overfør 200 mikroliter aliquots av hver råoljeprøve til individuelle rene, forhåndskjølte, merkede mikrocentrifugerør. For å fjerne cellevegger, rusk og store organeller, sentrifuge prøvene og dekantere supernatanten til friske, forhåndskjølte koniske rør for en ny sentrifugering. Mens rørene spinner, aliquot 60 mikroliter av magnetiske GFP perler per prøve, inn i en 1,5 milliliter tube.Og plasser røret på et magnetisk stativ, for å lette supernatant fjerning. Vask deretter perlene to ganger i en milliliter kald vaskebuffer per vask, og re-suspendere perlene i 60 mikroliter vaskebuffer per prøve. Umiddelbart etter sentrifugeringen, dekanterer den klarerte supernatanten til merkede 15 milliliter rør, og tilsett 60 mikroliter vasket perler til hver prøve.Deretter plasserer du alle prøvene horisontalt i en isbøtte, for en to timers inkubasjon med gynge. På slutten av inkubasjonen samler du perlene på et magnetisk stativ på is, og legger PMSF til den gjenværende polysome ekstraksjonsbufferen. Etter å ha kastet supernativa, tilsett omtrent fem milliliter polysom ekstraksjonsbuffer til prøvene, og re-suspendere perlene i prøvene med mild tilting.Rock prøvene i 15 minutter på shaker på is, etterfulgt av to vasker med fersk vaskebuffer på magneten, som demonstrert. Etter siste vask, overfør prøvene i en milliliter vaskebuffer, til et 1,5 milliliter rør. Og samle perlene en gang til på magnetstativet, for å fjerne alle de supernatante.Deretter plasserer du rørene på is til alle prøvene er behandlet. For rekondisjonering av laboratorieforsyningene, skyll først alt utstyret inn i det kjemiske avfallet. Håndvask mørtel, pestles og homogenisatorer med såpe, før skylling av hvert instrument grundig.Deretter plasserer du utstyret i en varmesikker beholder, og stek materialene over natten på mer enn 220 grader celsius. Pensle alle sentrifugerørene rene med vaskemiddel, før du plasserer rørene på et autoklaverbart brett med en kant og en røykhette. Hell en en milliliter flytende dietylpyrokarbonat og en liter deionisert vannløsning på rørene i tre til 18 timer.Deretter samler du opp løsningen før du steriliserer skuff med rør i autoklaven. Her vises representative anlegg med GFP-signaler. Motfarging med propidiumjodid markerer celleveggkonturene.Linjene tilsvarer lokaliseringsmønsteret til endodermis, og xylem-pole pericycle. I disse representative målingene hentet fra polysom RNA, viste de fleste prøvene svært lite nedbrytning, med RNA-integritetstall fra ni til 10. I disse grafene kan spor av vellykket forberedte biblioteker observeres, noe som fremhever prosedyrens robusthet, til tross for nedskalert reaksjonsvolum.Før et genom-omfattende datasett produseres, kan TRAP RNA fra et piloteksperiment undersøkes av kvantitativ RTPCR for å validere behandlingssuksessen og/eller de eksperimentelle forholdene, samt vevspesifisiteten. I denne analysen bekreftet testingen av tre auxin-responsive gener en vellykket hormoninduksjon etter to timers behandling. Vevsspesifikke markørgenprofiler hentet fra sekvenseringsdataene bekreftet celletypespesifisitet.Følg gode treningsråd når du håndterer RNA. Arbeid på en steril benk, rengjør utstyret med RNA-fjerningsløsning, bruk hansker og bytt dem umiddelbart når de blir forurenset. Pass på å håndtere og kaste alle giftige kjemikalier og gasser som har blitt brukt under prosedyren, spesielt fenol-DEPC klorgass og flytende nitrogen.I porteføljen av omic studier, TRAP opptar en viktig nisje, og har allerede blitt brukt til å svare på mange biologiske spørsmål, spesielt i utviklingsbiologi, TRAP har et stort potensial.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetiske Field (Gmf) og Plant Evolution: Gransker effekten av Gmf Reversal på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Utvikling og Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Bygge Finite Element Modeller for å etterforske sebrafisk Jaw Biomekanikk

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammer for langvarig konfokal imaging av rot og hypokotylutvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lysmediert reversibel modulering av den mitogenaktiverte proteinkinaseveien under celledifferensiering og<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonutvikling

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av larver sebrafisk som et dyr-modellen for å undersøke Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...